作者：程松

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導(dǎo)語(yǔ)

本研究成功實(shí)現(xiàn)了僅憑一根羽毛即可精準(zhǔn)判別鸚鵡性別，為解決鸚鵡人工繁育、瀕危物種保護(hù)及進(jìn)化研究中的性別鑒定瓶頸提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

摘要

鸚鵡為單態(tài)性鳥, 很難通過外觀和形態(tài)來進(jìn)行性別鑒定，傳統(tǒng)的性別鑒定方法不再適合單態(tài)性物種，給人工配對(duì)與繁殖造成了困難。本實(shí)驗(yàn)利用非傷害性取樣方法，提取10只已知性別鸚鵡羽毛的基因組DNA，然后通過引物Sex F/Sex R的對(duì)其CHD基片段進(jìn)行擴(kuò)增，Sex F/Sex R的PCR產(chǎn)物大小分別是650bp與500bp，結(jié)果顯示,特異性引物從雄性鸚鵡中擴(kuò)增出1條片段, 從雌性鸚鵡中擴(kuò)增出2條片段, 均可以對(duì)鸚鵡的性別作出了準(zhǔn)確鑒定, 解決了鸚鵡人工繁育中的關(guān)鍵問題。

關(guān)鍵詞：鸚鵡；性別鑒定；CHD基因

前言

鸚鵡屬于鸚形目（Psittaciformes），有鸚鵡科和鳳頭鸚鵡科2個(gè)科、82個(gè)屬、358個(gè)種，是當(dāng)今鳥綱中最大的科之一，屬于典型的攀禽，分布在世界各地的熱帶地區(qū)。鸚鵡以其靚麗的羽毛以及能夠模仿人類語(yǔ)言等特點(diǎn)，被大多數(shù)人欣賞和愛護(hù)，因而經(jīng)常被人們作為寵物飼養(yǎng)，而它們的野生種群也因此受到了威脅， 許多種類都已經(jīng)成為瀕危物種。鸚鵡是一種單態(tài)性鳥，即雌雄同型，它們的性別鑒定很難通過外觀以及其他行為進(jìn)行判斷區(qū)別，這給配對(duì)造成了很大的困難。在動(dòng)物園或鸚鵡養(yǎng)殖場(chǎng)中，如果可以通過鑒定雛鳥的性別，就能淘汰非目的的性別個(gè)體，也能降低飼養(yǎng)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，并且在人工飼養(yǎng)管理、有效的繁殖、遺傳研究與疾病防治等方面有重要的意義，尤其是對(duì)如今一些瀕危的珍稀鳥類的保護(hù)與管理具有重要的意義。

目前，可用于鑒定單態(tài)性鳥或雙態(tài)性幼鳥性別的傳統(tǒng)方法有：目測(cè)性器官；通過組織培養(yǎng)進(jìn)行染色體分析；測(cè)定糞便中雌激素與睪酮比例；對(duì)性腺進(jìn)行直接造影的內(nèi)窺鏡及超聲波檢查；體尺測(cè)量法；用錄音機(jī)錄下鳴叫聲比較聲波頻率等；這些方法的性別鑒定，耗體力、可靠性差、且鑒定結(jié)果誤差大。鳥類的性染色體為ZW型，ZZ為雄性，ZW為雌性。隨著近年來，分子生物學(xué)的高速發(fā)展，分子鑒定鳥類的性別的措施也趨于盛行。其實(shí)驗(yàn)過程較于傳統(tǒng)方法更簡(jiǎn)便、其實(shí)驗(yàn)結(jié)果比傳統(tǒng)方法也更準(zhǔn)確、實(shí)驗(yàn)材料的采集也更簡(jiǎn)單方便。尤其是對(duì)于瀕危野生動(dòng)物，非損傷采樣法的運(yùn)用更主流化[1]。分子性別鑒定是目前比較廣泛使用的方法。對(duì)于非平胸鳥類，應(yīng)用最多的是CHD基因，染色體螺旋蛋白基因（chromobox-helicase-DNA binding gene），

CHD基因十分保守，并且有兩個(gè)同源拷貝CHD-W和CHD-Z。其中CHD-W是關(guān)于W連鎖，

CHD-Z是關(guān)于Z連鎖[2-3]。雌性個(gè)體中具有兩個(gè)同源拷貝 CHD-W和 CHD-Z ，而雄性個(gè)體中只有 CHD-Z。故雄性個(gè)體（ZZ）只有一個(gè)拷貝CHD-Z，只有一個(gè)條帶；雌雄個(gè)體（ZW）有兩個(gè)拷貝 CHD-Z、CHD-W，可顯示出兩個(gè)條帶。因此，本研究通過對(duì)10只已知性別的鸚鵡進(jìn)行性別鑒定，旨在探索一種簡(jiǎn)便且準(zhǔn)確度高的鸚鵡的性別鑒定方法，這對(duì)于動(dòng)物園與鸚鵡繁殖場(chǎng)的人工飼養(yǎng)、保護(hù)物種以及繁殖育種等至關(guān)重要。

一、材料與試劑

1.1儀器

超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司）、FA1604 型電子分析天平（上海天平儀器廠）、PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司）、高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）、DY-A型電泳儀（上?？颠_(dá)電子儀器廠）、Hema紫外透射分析儀凝膠成像系統(tǒng)（珠海市黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）、水浴鍋（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司）、渦旋震蕩儀（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）、微波爐（佛山順德區(qū)美的微波爐電器制造有限公司）、移液槍（德國(guó)eppendorf公司）

1.2 試劑

Forensic DNA Kit提取試劑盒、Mix均購(gòu)自于OMEGA公司，核酸染料GoodView、DNA Marker DL2000、瓊脂糖、50X TAE電泳緩沖液購(gòu)自Invitrogen公司、無水乙醇購(gòu)自深圳市東茂化學(xué)試劑有限公司

1.3 材料

11只鸚鵡的羽毛由廣州某寵物醫(yī)院提供，均已通過繁殖證實(shí)性別，編號(hào)分別為 HP01、 HP02、HP03、HP04、MD05、MD06、MD07、MD08、XF09與XF10，進(jìn)行DNA抽提，保存在﹣20℃?zhèn)溆谩?/p>

二、實(shí)驗(yàn)方法

2.1引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Genbank已公布的CHD的基因組序列，利用分子生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)了1對(duì)CHD基因的引物，為Sex F/Sex R，Sex F/Sex R目的片段大小為650bp與500bp，引物序列如下：

Sex F：5′- GTTACTGATTCGTCTACGAG -3′；

Sex R：5′- ATTGAAATGATCCAGGCTTG-3′；

引物由廣州睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

2.2 鸚鵡羽毛DNA的提取

在10個(gè)無菌的2mL的EP管的管壁標(biāo)記HP01、 HP02、HP03、HP04、MD05、MD06、MD07、MD08、XF09與XF10，然后在每管加入血液50uL，加入200uL Buffer STL，60℃水浴15min，加入25uL蛋白酶K，混勻，加入225uL Buffer BL與225uL無水乙醇，混勻，然后用DNA Wash Buffer洗滌，最后用40uL預(yù)熱到70℃的Elution Buffer溶解DNA，DNA保存在﹣20℃?zhèn)溆?；具體的步驟參照OMEGA公司的Forensic DNA Kit試劑盒說明書。

2.3 PCR擴(kuò)增與PCR擴(kuò)增體系

PCR反應(yīng)體系：

以羽毛中提取的DNA為模板，以Sex F/Sex R為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為25ul：2×Trans Taq-TPCRSuperMix 12.5ul、模板DNA 1.0uL、Sex F 1.0uL、Sex R 1.0uL、ddH2O 9.5uL；

反應(yīng)程序?yàn)椋?/strong>

95℃ 4mi n；94℃ 30 s ，44℃ 30 s，72℃ 50s，35個(gè)循環(huán)；72℃，10 min，PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物放入4℃保存。

2.4 瓊脂糖凝膠電泳

取8uL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，120V，20min結(jié)束后，用Hema紫外透射分析儀凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，拍照記錄，使用DNA Marker DL2000進(jìn)行標(biāo)記。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 CHD基因Sex F/Sex R引物對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)10份鸚鵡的羽毛樣品，Sex F/Sex R引物經(jīng)過PCR擴(kuò)增之后，再經(jīng)過電泳結(jié)果顯示，雄性個(gè)體顯示為一條帶CHD-Z（500bp），雌性個(gè)體顯示為兩條帶CHD-Z（500bp）、CHD-W（650bp）。與預(yù)期的目的條帶相符(圖1)。

M:2000bp DNA Maker；1-10:鸚鵡CHD基因PCR產(chǎn)物;

圖1 鸚鵡CHD基因的PCR檢測(cè)結(jié)果

3.2 鸚鵡性別鑒定結(jié)果

10只鸚鵡性別鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表1。

表1 10只鸚鵡性別鑒定結(jié)果

四、討論分析

鳥類的基因型為ZW型（ZZ為雄性，ZW為雌性），隨著城市化與工業(yè)化的快速發(fā)展，以及不法分析的非法捕殺的影響，我們賴以生存的生態(tài)環(huán)境正在遭受到污染與破壞，導(dǎo)致許多珍稀鳥類正在瀕臨種族滅絕的危險(xiǎn)。因此很多動(dòng)物園模擬鳥類的野外生活環(huán)境，讓它們有更好的棲息與繁殖的環(huán)境，提高它們的存活率與繁殖率。動(dòng)物的繁殖與育種，都離不開動(dòng)物的個(gè)體性別的鑒定 [4-5] 。世界上60%鳥類是單態(tài)性鳥，即雌性同型，很難在外形上、生理上以及行為上進(jìn)行性別鑒定，即使對(duì)于一些雌雄異性的鳥類進(jìn)行性別鑒定也很難，只有在性成熟后，雌雄在形態(tài)上才有區(qū)別，特別是對(duì)雛鳥進(jìn)行性別鑒定就更難了。因此，分子生物學(xué)方法便成為鳥類性別鑒定的簡(jiǎn)便與有效的方法，早期主要是使用RAPD、熒光標(biāo)記性染色體基因探針、Southen雜交幾乎可以鑒定所有的鳥類 [6-7] 。

后來發(fā)展到用PCR方法擴(kuò)增性染色連鎖基因的特異性區(qū)段序列，CHD基因被Griffiths等 [7] 發(fā)現(xiàn)，其進(jìn)化速率慢，在所有的非平胸鳥類中都非常保守，根據(jù)在Z/W染色體上的分布以及序列差異，從而快速簡(jiǎn)便對(duì)鳥的性別進(jìn)行鑒定。Griffiths等利用P2/P8引物對(duì)雞形目等28個(gè)種的鳥進(jìn)行性別鑒定，其中只有對(duì)平胸鳥類中的鴕鳥不能做出正確的鑒定，因此該方法在非平胸目非常適用[8]。江杉等利用引物P2/P8擴(kuò)增出CHD基因片段，成功鑒別鸛形目5種鷺科鳥類與1種鹮科鳥類 [9] ，袁夢(mèng)利用2550F/2718R引物擴(kuò)增出CHD基因片段，對(duì)鵜鶘的性別進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行了常見鳥類的相應(yīng)同源性序列進(jìn)行聚類分析。胡銳穎等同樣以2550F/2718R引物，成功的鑒定出了綠孔雀、白鶴、黑頸鶴、白頭鶴、白枕鶴、東方白鶴等國(guó)家一級(jí)保護(hù)鳥類進(jìn)行性別鑒定 [10] 。

目前在鳥類研究中，主要是采集換羽期的羽毛，從羽毛中提取基因組DNA。 Trefil et al證實(shí)了可以利用鳥類羽毛提取DNA。目前主要是從羽毛根部 提取基因組DNA，在拔取羽毛的過程中，該部位可能會(huì)帶有部分血液或組織，因此提取物中DNA量較多，不含蛋白質(zhì)和RNA等物質(zhì)，在提取過程中不易發(fā)生DNA降解情況。另外，田秀華等為解決珍稀瀕危鳥類分子生物學(xué)研究中存在的取樣局限性問題，對(duì)大鴇羽毛的不同部位的DNA提取進(jìn)行了研究。研 究發(fā)現(xiàn)羽毛羽根部位可以提出一定純度的核DNA和mtDNA，這些研究拓寬了珍稀 瀕危鳥類采樣的范圍，為珍稀瀕危鳥類的分子生物學(xué)研究提供了更廣闊的樣品來源。本研究采集鸚鵡換羽期的次級(jí)飛羽，從羽根部位提取基因組DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羽根部位提取的一定純度和濃度的DNA，能夠順利進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

本研究前期利用引物對(duì)Sex F/Sex R對(duì)已知性別的鸚鵡進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，性別鑒定結(jié)果與已只鸚鵡的性別完全一致。目前，鸚鵡性別鑒定的分子生物學(xué)方法主要被科研機(jī)構(gòu)和一些專門從事鳥類性別鑒定的商業(yè)公司應(yīng)用，但是隨著鸚鵡育種、瀕危鸚鵡物種保護(hù)以及進(jìn)化研究等方面的工作越來越受到重視，該種方法的應(yīng)用范圍必將逐漸擴(kuò)大，并且會(huì)產(chǎn)生廣闊的市場(chǎng)前景。希望這種技術(shù)將為今后鸚鵡繁殖育種、保護(hù)瀕危的物種以及國(guó)際交流瀕危鳥類提供可靠的技術(shù)資料，對(duì)鳥類的人工繁殖、細(xì)胞遺傳學(xué)以及進(jìn)化生物學(xué)的研究具有重要的意義。

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[1]田秀華，劉鑄，何相寶，等.7種鶴形目鳥類性別的分子鑒定[J].動(dòng)物學(xué)雜志，2006（05）：62-67.

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編 輯|張秋雁

審 核|郭羽麗