研究背景與目的

成人腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，其中膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma，GBM）最常見且惡性程度最高，中位總生存期僅14.6個月。其治療面臨化療耐藥、浸潤性生長等多重挑戰(zhàn)，而膠質(zhì)母細胞瘤的顱外轉(zhuǎn)移較為罕見（發(fā)生率0.4%-0.5%），其臨床特征、生物學機制及腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）的特征仍缺乏系統(tǒng)認知。

在生理層面，血腦屏障、硬腦膜等生理屏障理論上可阻止腫瘤細胞擴散，但臨床已觀察到20%-39%的GBM患者存在循環(huán)腫瘤細胞，且有膠質(zhì)母細胞瘤通過器官移植傳播的案例。外科干預（如神經(jīng)外科開顱手術(shù)、腦室腹腔分流術(shù)）被推測為潛在轉(zhuǎn)移誘因，但無手術(shù)史患者的轉(zhuǎn)移案例也提示腫瘤自身具備轉(zhuǎn)移潛能。此外，傳統(tǒng)研究多依賴免疫組織化學（IHC），且局限于個案分析，全基因組DNA甲基化譜等前沿技術(shù)在膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移研究中應用極少，TME中免疫細胞與腫瘤干細胞樣細胞的作用亦未明確。

基于上述研究空白，本研究旨在通過多種技術(shù)（NGS、全基因組甲基化、RNA測序、IHC等），對迄今規(guī)模最大的成人轉(zhuǎn)移性膠質(zhì)瘤隊列進行分析，以闡明轉(zhuǎn)移灶的克隆起源、表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及TME特征，為臨床診斷與治療提供依據(jù)。

材料與方法

1.患者隊列與樣本

本研究初始納入20例成人轉(zhuǎn)移性膠質(zhì)瘤，排除2例組織樣本不足及2例非轉(zhuǎn)移腫瘤（腦脊液播散、通過腦室腹腔分流管播散）后，最終納入16例患者（1999-2019年，丹麥哥本哈根大學醫(yī)院），包括14例GBM（IDH野生型，WHO4級）及2例低級別膠質(zhì)瘤（1例IDH突變星形細胞瘤，WHO 2-3級；1例IDH突變，1p/19q缺失少突膠質(zhì)細胞瘤，WHO 2-3級）。樣本類型為配對的福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織：原發(fā)腫瘤、顱內(nèi)復發(fā)腫瘤（優(yōu)先最新的復發(fā)腫瘤，2例因原發(fā)腫瘤不足用首次復發(fā)腫瘤替代）、轉(zhuǎn)移灶（5例手術(shù)切除，2例尸檢獲?。?名神經(jīng)病理學家按2021年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類重新評估，必要時補充膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）染色驗證。

2.研究技術(shù)與方法

（1）影像學評估

分析原發(fā)腫瘤以及轉(zhuǎn)移腫瘤的MRI影像，包括T1增強、T2、FLAIR序列。分析強化模式、中央壞死、FLAIR/T2不匹配現(xiàn)象、腫瘤占位效應與體積。并評估腫瘤與硬腦膜、腦室、大血管的距離，以探究轉(zhuǎn)移途徑。

（2）分子檢測

包括DNA提取、二代測序（NGS）、全基因組DNA甲基化譜（Illumina Infinium MethylationEPIC（850K）芯片檢測）、RNA測序，具體細節(jié)詳見原文。

研究結(jié)果

1.臨床特征

轉(zhuǎn)移部位分布：轉(zhuǎn)移至頭皮/上頸部8例（50%）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5例（31.25%）、骨轉(zhuǎn)移2例（12.5%）、肝轉(zhuǎn)移1例（6.25%）【圖1A】。8例頭皮/上頸部轉(zhuǎn)移中6例存在顱內(nèi)病灶經(jīng)顱骨鉆孔延伸至顱外現(xiàn)象，此類腫瘤非真性轉(zhuǎn)移。其余10例為真性轉(zhuǎn)移（原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶無解剖連接）【圖1B】。

圖1：患者特征概述。（A）轉(zhuǎn)移部位概述；（B）MRI掃描（T1增強）顯示強化腫瘤通過開顱術(shù)鉆孔延伸，伴顱外強化腫瘤（箭頭）（左）；遠處脊柱骨性轉(zhuǎn)移伴硬膜外壓迫（箭頭）（平掃）（右）；（C）Kaplan-Meier曲線顯示膠質(zhì)母細胞瘤患者的總生存期，其中包括真性轉(zhuǎn)移（8例）和顱外延伸（6例）（log-rank p=0.028）。（顯著性水平p<0.05）。（D）患者疾病發(fā)展的時間線，從確診到死亡，包括開顱術(shù)時間點（組織病理學報告日期）。

病理亞型：14例GBM中6例表現(xiàn)為肉瘤分化（符合膠質(zhì)肉瘤GS亞型）。2例低級別膠質(zhì)瘤均進展至高級別（WHO 3級）。

人口學與生存情況：男12例、女4例，診斷中位年齡為56.5歲（27-65歲）。顱外延伸組開顱手術(shù)次數(shù)顯著多于真性轉(zhuǎn)移組（3 vs 2，p=0.0450），且總生存期（OS）更長（17.5 vs 7.5個月，p=0.0288）【圖1C】。GBM患者中位OS為12.5個月（范圍5-44個月），轉(zhuǎn)移后中位生存期86天（15-200天）；2例低級別膠質(zhì)瘤OS分別為147個月、35個月【圖1D】。

治療與分子標志物：11例患者初治方案包括放療聯(lián)合替莫唑胺化療。GBM中MGMT啟動子甲基化率14%（2/14），低級別膠質(zhì)瘤中為100%（2/2）。4例GBM存在TERT啟動子熱點突變【表1，詳見原文】。

2.影像學特征

在腫瘤轉(zhuǎn)移途徑方面，未發(fā)現(xiàn)腫瘤與硬腦膜、腦室、大血管的距離與轉(zhuǎn)移能力的相關性，但6例顱外延伸患者中，5例在手術(shù)鉆孔處觀察到異常強化，提示腫瘤沿手術(shù)路徑生長。1例顱外延伸患者見顱底強化，但與鉆孔關聯(lián)不明確。原發(fā)腫瘤影像學均符合高級別膠質(zhì)瘤典型特征，包括對比增強、中央壞死、FLAIR序列高信號（提示瘤周水腫）；無FLAIR/T2不匹配現(xiàn)象（IDH突變型膠質(zhì)瘤的特征性標志）；腫瘤體積22.0-104.4cm3，與非轉(zhuǎn)移GBM體積分布無明顯差異。

3.克隆起源與遺傳特征

本研究對腫瘤的突變譜進行分析，共檢測413個基因的1491個非同義體細胞突變，高頻突變?yōu)镻IK3CA、EGFR、PTEN、NOTCH1、SMARCA4【圖2A】。未發(fā)現(xiàn)DNA損傷修復通路（如錯配修復）突變，亦無微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）證據(jù)。同源重組通路亦無異常。顱外延伸組的原發(fā)腫瘤TMB有升高趨勢，但無統(tǒng)計學意義。

4例腫瘤存在TERT啟動子熱點突變。在13例GBM中，有8例的關鍵拷貝數(shù)變異（CDKN2A/B純合缺失、+7/-10染色體異常、EGFR擴增）完全保留【圖2B】。所有患者腫瘤的MGMT甲基化狀態(tài)在疾病進展過程中保持穩(wěn)定。

研究者對6名患者縱向采集的腫瘤樣本的變異等位基因頻率和拷貝數(shù)動態(tài)變化進行研究，以探索驅(qū)動腫瘤進展和轉(zhuǎn)移的機制。5名患者的顱內(nèi)復發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤均起源于原發(fā)腫瘤。僅有2名患者的顱內(nèi)復發(fā)腫瘤缺乏致癌基因突變【圖2C，詳見原文】。這表明膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移起源于原發(fā)腫瘤。

圖2A-B：轉(zhuǎn)移性成人膠質(zhì)瘤的分子特征。（A）Oncoprint圖顯示原發(fā)、復發(fā)及顱外轉(zhuǎn)移灶的突變圖譜。每列對應單個樣本，按患者系統(tǒng)排列；y軸列出臨床相關突變基因，不同顏色代表臨床信息和突變功能；（B）通過DKFZ腦腫瘤分類器V.12.5鑒定的差異腫瘤亞群關鍵分子特征。

4.表觀遺傳動態(tài)（甲基化譜改變）

甲基化譜分析顯示，68%（21/31）的腫瘤的甲基化類別可以可靠地進行歸類（DKFZ分類器得分≥0.84）。原發(fā)GBM中最常見的甲基化類別為GBM_MES型（間質(zhì)型，43%）與GBM_RTK2型（21%），轉(zhuǎn)移灶中兩類別的分布比例相似（MES型43%、RTK2型14%）。

平均腫瘤純度15%-92%，原發(fā)、復發(fā)、轉(zhuǎn)移灶間無顯著差異。但腫瘤純度與甲基化類別得分顯著相關（R=0.3564，p=0.0490），提示純度可能影響甲基化分類的可靠性。

對所有樣本中變異程度最高的1%的探針進行無監(jiān)督聚類分析，顯示8/14例患者的甲基化特征呈“患者特異性穩(wěn)定”（同一患者的不同階段樣本聚類在一起）【圖3A】；另外6例患者的甲基化特征不穩(wěn)定，其中2例（患者8、15）在進展過程中發(fā)生甲基化類別轉(zhuǎn)變（如從GBM_RTK2轉(zhuǎn)為GBM_MES）【圖3B】。

研究者在原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶間共鑒定60724個差異甲基化位點，其中多數(shù)（>90%）在轉(zhuǎn)移灶中呈低甲基化，提示腫瘤進展過程中存在全基因組DNA甲基化水平的下降。

圖3：原發(fā)腦腫瘤、顱內(nèi)復發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的全基因組DNA甲基化譜分析。（A）熱圖顯示甲基化特征中變異度前1%探針的無監(jiān)督層次聚類；（B）Sankey圖顯示DKFZ腦腫瘤分類器V.12.5預測的原發(fā)腦腫瘤、顱內(nèi)復發(fā)灶和顱外轉(zhuǎn)移灶的甲基化分類。

5.RNA測序揭示腫瘤進展過程中的亞型轉(zhuǎn)換

對5例GBM的ssGSEA分析顯示，2例原發(fā)腫瘤為經(jīng)典亞型，在復發(fā)和轉(zhuǎn)移中轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)亞型。1例不能獲得原發(fā)腫瘤，以第一次復發(fā)腫瘤代替。該腫瘤在進展過程中保持經(jīng)典亞型特征。相反的是，2例原發(fā)腫瘤為間質(zhì)亞型，1例轉(zhuǎn)移病灶保持了間質(zhì)亞型，另1例的復發(fā)病灶為經(jīng)典亞型，轉(zhuǎn)移病灶又轉(zhuǎn)換為間質(zhì)亞型。這說明轉(zhuǎn)錄亞型存在動態(tài)的轉(zhuǎn)換【圖4A，詳見原文】。

為探索真性轉(zhuǎn)移病灶和顱外延伸病灶是否由不同的轉(zhuǎn)錄程序激活，研究者對真性轉(zhuǎn)移和顱外延伸組的原發(fā)腫瘤【圖4B，詳見原文】以及復發(fā)、轉(zhuǎn)移腫瘤【圖4C，詳見原文】進行ssGSEA分析。真性轉(zhuǎn)移組的原發(fā)腫瘤中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）通路激活程度顯著更高（p<0.05），另外TGFβ信號傳導、γ干擾素反應、IL2-STAT5信號等炎癥相關通路激活。綜上，進展和轉(zhuǎn)移過程中存在轉(zhuǎn)錄可塑性以及RNA亞型轉(zhuǎn)換的證據(jù)。

6.腫瘤干性特征保持穩(wěn)定

基于甲基化干細胞特性估計值以及細胞標志物（SOX2、OLIG2）和神經(jīng)元標志物MAP2的的IHC結(jié)果顯示，在進展及轉(zhuǎn)移過程中干細胞特性未顯示出差異。這表明腫瘤的干細胞特性并非GBM發(fā)生轉(zhuǎn)移的關鍵驅(qū)動因素。

7.腫瘤微環(huán)境（TME）特征

腫瘤微環(huán)境被認為與轉(zhuǎn)移的發(fā)生有關。細胞類型解卷積顯示，原發(fā)和轉(zhuǎn)移腫瘤中均以單核細胞來源的細胞為主導；NK細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、單核細胞來源的細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞在疾病變化中水平相似，組間無顯著差異【圖5A】中無顯著變化。僅顱內(nèi)復發(fā)灶中B細胞比例顯著降低（p<0.05）。

通過定量分析免疫細胞標志物以研究免疫細胞組成。結(jié)果顯示顯示，CD8+T細胞、FOXP3+調(diào)節(jié)性T細胞和CD68+巨噬細胞的數(shù)量在原發(fā)、復發(fā)和轉(zhuǎn)移腫瘤中無顯著變化【圖5B-D，詳見原文】。與顱外延伸組相比，真性轉(zhuǎn)移組原發(fā)腫瘤的CD68 +巨噬細胞水平顯著降低（p=0.01，圖5D），且真性轉(zhuǎn)移組轉(zhuǎn)移腫瘤的CD68+巨噬細胞密度低于復發(fā)腫瘤（p=0.04）。

8. GFAP表達變化

與原發(fā)腦腫瘤相比，所有轉(zhuǎn)移灶中GFAP表達顯著降低或完全缺失，2例低級別膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移灶亦呈現(xiàn)相同模式。這說明腫瘤進展會導致星形膠質(zhì)細胞樣分化的喪失。

圖5A：小提琴圖和比例圖顯示原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶中B細胞、NK細胞、CD4?T細胞、CD8?T細胞、單核細胞衍生細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的細胞類型反卷積比例。中位數(shù)以水平線顯示，第25和75百分位數(shù)以虛線水平線顯示?；颊?和13的原發(fā)腫瘤無細胞類型反卷積數(shù)據(jù)，比例圖中顯示為空白柱。

討論與結(jié)論

本研究證實，成人膠質(zhì)瘤可出現(xiàn)真性的顱外轉(zhuǎn)移，以及向顱外延伸。顱外延伸組的預后相對較好。由于復發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤需要更多開顱手術(shù)治療，增加了向顱外延伸風險。值得關注的是，有2例存在頭皮病灶患者，最初被認為真性轉(zhuǎn)移。但進一步影像學檢查提示頭皮腫瘤均靠近顱骨鉆孔，因此可以用沿手術(shù)路徑種植來解釋。另外腫瘤通過腦膜淋巴管擴散也可能是轉(zhuǎn)移途徑之一。

本研究對轉(zhuǎn)移性膠質(zhì)母細胞瘤的MRI特征特征進行分析，發(fā)現(xiàn)諸多與轉(zhuǎn)移性膠質(zhì)母細胞瘤顯著相關的典型征象，如不均勻強化、中央壞死及明顯占位效應等，這些表現(xiàn)與膠質(zhì)母細胞瘤已確立的影像學表現(xiàn)一致，常表現(xiàn)為血腦屏障破壞以及壞死核心被周圍存活的腫瘤組織環(huán)繞。腫瘤體積范圍廣泛，與文獻中報道的非轉(zhuǎn)移性膠質(zhì)母細胞瘤體積情況相符，這表明腫瘤體積并不影響其轉(zhuǎn)移潛能。

通過對連續(xù)腫瘤樣本進行突變分析，在5名患者中發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤是轉(zhuǎn)移腫瘤的克隆起源，且復發(fā)和轉(zhuǎn)移瘤是平行演化的。甲基化譜分析顯示，至少有2例膠質(zhì)母細胞瘤在轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生了甲基化類別轉(zhuǎn)變。此前已有研究表明，膠質(zhì)母細胞瘤在復發(fā)時可能會發(fā)生甲基化類別轉(zhuǎn)變，而本研究首次表明這種轉(zhuǎn)變也可能發(fā)生在轉(zhuǎn)移過程中。在腫瘤進展和轉(zhuǎn)移過程中存在全基因組DNA甲基化水平的下降，仍需進一步研究這一現(xiàn)象在膠質(zhì)母細胞瘤轉(zhuǎn)移中的作用。另外腫瘤進展及轉(zhuǎn)移過程中存在亞型的動態(tài)轉(zhuǎn)換，盡管樣本量有限，但總體趨勢是向間質(zhì)亞型轉(zhuǎn)變。

在真性轉(zhuǎn)移瘤中，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）通路被激活的現(xiàn)象更顯著，這可能表明EMT通路的激活在真性轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)展中起著重要作用。同樣的分析還顯示，在發(fā)生真性轉(zhuǎn)移的患者中，各種免疫反應通路的表達上調(diào)，盡管樣本量有限無法得出確切結(jié)論，但這可能意味著與顱外延伸相比，真性轉(zhuǎn)移時免疫微環(huán)境的參與更為積極。

關于干細胞特性的分析中，基于甲基化的干細胞指數(shù)以及對細胞標志物OLIG2和SOX2的定量檢測結(jié)果均顯示，原發(fā)、復發(fā)和轉(zhuǎn)移瘤之間無顯著差異。研究結(jié)果表明，干細胞特性并非膠質(zhì)母細胞瘤轉(zhuǎn)移進程迄今為止的驅(qū)動因素。

至今為止，尚無研究分析膠質(zhì)母細胞瘤轉(zhuǎn)移病灶的免疫微環(huán)境與原發(fā)腫瘤的差異。本研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤和繼發(fā)腫瘤的免疫細胞組成驚人地相似。因此，廣為接受的“免疫豁免腦”這一概念似乎并不適用于發(fā)生轉(zhuǎn)移的膠質(zhì)母細胞瘤。不過，出現(xiàn)顱外延伸的患者原發(fā)腫瘤中CD68+巨噬細胞的水平高于真性轉(zhuǎn)移。鑒于巨噬細胞可促進腫瘤細胞遷移，可以推測它們可能參與了向顱外延伸的過程。

本研究結(jié)果表明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與了膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移。多個轉(zhuǎn)移灶GFAP的表達降低，這反映了腫瘤進展過程中星形膠質(zhì)細胞樣分化的喪失。本研究的甲基化分析表明甲基化類別向間質(zhì)亞型轉(zhuǎn)變，顯示膠質(zhì)瘤在發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中在表觀遺傳水平上具有可塑性。在轉(zhuǎn)錄水平上也觀察到了同樣的模式。我們的隊列中還包含異質(zhì)性多的膠質(zhì)肉瘤，我們推測這種亞型特有的間質(zhì)成分增加了轉(zhuǎn)移的可能性。

總之，本研究證明原發(fā)腫瘤是膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移病灶的克隆起源。膠質(zhì)瘤向顱外延伸與真性轉(zhuǎn)移是不同的。另外腫瘤發(fā)展過程中存在表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄亞型的可塑性。而腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞成分不受轉(zhuǎn)移部位的影響，這表明未來針對膠質(zhì)瘤的腫瘤微環(huán)境導向療法可能對轉(zhuǎn)移灶也有效。

參考資料：Clinical, radiological, and molecular insights into extracranial metastases from adult gliomas. Neuro-Oncology,2025. doi:10.1093/neuonc/noaf178

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