導(dǎo)讀：登革熱是由登革病毒（DENV）引起的蚊媒傳染病，全球每年感染人數(shù)高達(dá)4億，兒童和青少年是重癥高危人群。ADE（抗體依賴性增強(qiáng)）風(fēng)險(xiǎn)是登革病毒疫苗開發(fā)的關(guān)鍵障礙。

2025年5月，臺(tái)北細(xì)胞與個(gè)體生物學(xué)研究所人員通過(guò)設(shè)計(jì)DENV E蛋白抗原表位（DENV2亞型來(lái)源的E N8R突變體），制備了一款mRNA-LNP 疫苗。實(shí)驗(yàn)表明，E N8R-mRNA-LNP 疫苗誘導(dǎo)的抗體滴度高于野生型E蛋白（E WT），且ADE 效應(yīng)顯著降低。在小鼠體內(nèi)保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，E N8R 疫苗血清對(duì) DENV2 的保護(hù)效果優(yōu)于 WT。該研究為開發(fā)低 ADE 風(fēng)險(xiǎn)的登革熱四價(jià) mRNA 疫苗提供了依據(jù)。研究成果發(fā)表于Vaccine期刊。

01

研究背景

登革病毒（DENV）分為 4 種血清型（DENV1-4），各型間氨基酸序列差異達(dá) 35%，二次感染異源血清型時(shí)，可能因抗體依賴增強(qiáng)（ADE）導(dǎo)致重癥或死亡。現(xiàn)有疫苗Dengvaxia（CYD-TDV）、Qdenga（TAK-003）均為四價(jià)疫苗，但對(duì)個(gè)別亞型的保護(hù)效力較低。

E蛋白是病毒入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵，其結(jié)構(gòu)域II（EDII）的融合環(huán)區(qū)高度保守，但易誘導(dǎo)交叉反應(yīng)抗體（引發(fā)ADE）。既往研究發(fā)現(xiàn)，DENV2 E 蛋白的 N8 表位突變（N8R）可降低 DNA 疫苗的 ADE 風(fēng)險(xiǎn)，但 DNA 疫苗的抗體滴度較低。因此，這項(xiàng)研究轉(zhuǎn)向 mRNA-LNP 平臺(tái)編碼E蛋白N8R突變體，以提升免疫原性、降低ADE效應(yīng)。

02

研究方法與結(jié)果

2.1 E N8R mRNA疫苗的制備

合成野生型（WT）和 N8R 突變型的DENV2 E 蛋白（1-394 氨基酸，DENV2亞型來(lái)源）編碼mRNA，引入 5' 和 3' 非翻譯區(qū)（UTR）增強(qiáng)穩(wěn)定性，并使用 N1-甲基假尿苷修飾降低免疫原性。通過(guò)微流控技術(shù)將 mRNA 包封于LNP，脂質(zhì)成分為 D-Lin-MC3-DMA（陽(yáng)離子脂質(zhì)）、DSPC（磷脂）、膽固醇和 PEG-脂質(zhì)，摩爾比 50:10:38.5:1.5。

理化性質(zhì)分析顯示，E WT mRNA-LNP、E N8R mRNA-LNP疫苗的粒徑分別為110 nm、95 nm，均一性良好（PDI<0.2）。二者的Zeta 電位為+8.1、+ 12.5 mV，確保細(xì)胞攝取效率。包封效率均>95%，且 mRNA 在 LNP 中穩(wěn)定，經(jīng) Triton X-100 處理后可完整釋放。

2.2 E N8R mRNA疫苗的體外試驗(yàn)

分別將E WT mRNA-LNP、E N8R mRNA-LNP轉(zhuǎn)染至 293T 細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)蛋白表達(dá)。使用三種單克隆抗體（DB32-6、DB39-2、4G2）驗(yàn)證突變的影響。

結(jié)果顯示，DB39-2抗體（結(jié)合N8表位）僅與野生型E蛋白結(jié)合，突變體無(wú)信號(hào)。DB32-6（結(jié)合結(jié)構(gòu)域III）和4G2（結(jié)合EDII保守區(qū)）與兩種抗原均能結(jié)合，且信號(hào)強(qiáng)度無(wú)顯著差異，證明E N8R突變未破壞E蛋白EDIII 和 EDII 的結(jié)構(gòu)完整性。

2.3 E N8R mRNA疫苗的體內(nèi)試驗(yàn)

通過(guò)小鼠試驗(yàn)評(píng)估兩種mRNA疫苗的免疫原性。8 周齡 BALB/c 小鼠肌肉注射 10 μg mRNA-LNP，間隔 2 周免疫 3 次，末次免疫后 2 周采血檢測(cè)。

結(jié)果顯示，E N8R mRNA-LNP組 EC??值高于 WT 組，具體為：針對(duì) DENV1/2/3/4 的抗體水平分別提升 3.1、3.3、1.2、2.2 倍，其中對(duì) DENV2 的抗體滴度最高。

長(zhǎng)期免疫原性：免疫后160 天檢測(cè)，E N8R mRNA組對(duì) DENV2 的抗體水平仍維持較高水平，表明疫苗可誘導(dǎo)持久免疫。

中和抗體檢測(cè)（PRNT assay）：E N8R mRNA組中和抗體反應(yīng)高于WT組（PRNT??：18,575vs. 16,222）。

2.4 E N8R mRNA疫苗的ADE效應(yīng)評(píng)估

研究通過(guò)體外ADE 模型（Fcγ受體陽(yáng)性K562 細(xì)胞）評(píng)估了E N8R mRNA疫苗的ADE效應(yīng)。在增強(qiáng)抗體存在的情況下，K562細(xì)胞可以通過(guò)Fc介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被病毒感染。

結(jié)果顯示，在1:1500 和 1:7500 稀釋條件下，N8R mRNA組血清病毒復(fù)制量顯著低于 WT組。

2.5 E N8R mRNA疫苗的保護(hù)效力

將免疫血清與DENV2 混合后接種 2 日齡乳鼠，觀察 21 天存活率。

結(jié)果顯示，N8R mRNA組保護(hù)效果顯著優(yōu)于 WT 組，1:100 稀釋血清保護(hù)率達(dá) 100%，1:400 稀釋時(shí)存活率仍高于 WT 組（80% vs 50%）。

03

結(jié)語(yǔ)

研究通過(guò)單點(diǎn)突變（N8R）破壞登革病毒（DENV）E蛋白ADE相關(guān)表位，同時(shí)保留中和表位（如 EDIII 和 EDII），實(shí)現(xiàn)了“免疫原性增強(qiáng)”與“ADE效應(yīng)降低”的平衡。同時(shí)借助了mRNA-LNP疫苗平臺(tái)的優(yōu)越性，相較于傳統(tǒng) DNA 疫苗，mRNA-LNP 誘導(dǎo)的抗體滴度提升約 10 倍，且生產(chǎn)流程標(biāo)準(zhǔn)化，適合快速應(yīng)對(duì)病毒變異。

目前研究?jī)H驗(yàn)證了DENV2血清型來(lái)源的抗原，有待擴(kuò)展至 DENV1/3/4，以開發(fā)四價(jià)登革疫苗。

參考文獻(xiàn)

[1] Kumari M, Su SC, Lin HT, Ko SH, Lu YF, Chen KC, Chen WY, Wu MJ, Wu HC. Enhanced immunogenicity of an mRNA vaccine against dengue virus serotype 2 with modified key residue. Vaccine. 2025 May 14;57:127216. doi: 10.1016/j.vaccine.2025.127216.

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撰寫| RNA星球

校稿| Gddra編審| Hide / Blue sea

編輯 設(shè)計(jì)| Alice