LALA 技術(shù)是抗體工程中的一個關(guān)鍵方法，主要用于改造抗體的 Fc 區(qū)域。Fc 區(qū)域是抗體與免疫系統(tǒng)其他組成部分（如補(bǔ)體系統(tǒng)和 Fc 受體）相互作用的部分。LALA 技術(shù)通過引入特定的突變來改變 Fc 區(qū)域的性質(zhì)，從而調(diào)控抗體的功能。

技術(shù)細(xì)節(jié)

LALA 技術(shù)的核心在于對抗體 Fc 區(qū)域的兩個關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行突變：

• Leu234Ala: 將位置 234 的亮氨酸（Leucine, L）突變?yōu)楸彼幔ˋlanine, A）。

• Leu235Ala: 將位置 235 的亮氨酸（Leucine, L）突變?yōu)楸彼幔ˋlanine, A）。

這些突變位于 Fc 區(qū)域的 CH2 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與 Fcγ 受體（Fc gamma receptors, FcγRs）結(jié)合。

FcγRs 是免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、NK 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等）表面的受體，能夠識別和結(jié)合抗體的 Fc 區(qū)域，從而觸發(fā)免疫細(xì)胞的效應(yīng)功能，例如抗體依賴的細(xì)胞毒性（ADCC）、抗體依賴的細(xì)胞吞噬（ADCP）等。

LALA 技術(shù)的作用機(jī)制

LALA 突變通過改變 Fc 區(qū)域的結(jié)構(gòu)，顯著降低了抗體與 FcγRs 的結(jié)合能力。這意味著：

• 減少免疫細(xì)胞的激活：抗體不再能夠有效地激活免疫細(xì)胞，減少了由此引發(fā)的炎癥反應(yīng)和組織損傷。

• 降低抗體的免疫原性：LALA 突變可以減少抗體被免疫系統(tǒng)識別和清除的可能性，從而延長其在體內(nèi)的半衰期。

• 減少非特異性結(jié)合：降低抗體與非目標(biāo)細(xì)胞的結(jié)合，提高其對目標(biāo)抗原的特異性，從而減少免疫系統(tǒng)副反應(yīng)，避免損傷血細(xì)胞，提升安全性。

歷史上關(guān)于LALA技術(shù)的重要事件

2006年3月13日，六名健康男性在輸注實(shí)驗(yàn)性抗體TGN1412后出現(xiàn)嚴(yán)重副作用，引發(fā)了危及生命的細(xì)胞因子風(fēng)暴，導(dǎo)致部分志愿者永久性傷害。其中，TGN1412是一種針對免疫系統(tǒng)的IgG4抗體，用于治療白血病和自身免疫性疾病。

科學(xué)家們調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，TGN1412靶向T細(xì)胞上的CD28抗原，會誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和炎癥性細(xì)胞因子釋放。它是一種“超級激動劑”，能向T細(xì)胞傳遞強(qiáng)烈信號。人類和食蟹猴CD28表達(dá)的差異可能是臨床前研究未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)的原因。此外，細(xì)胞激活還需要抗體的Fc區(qū)參與，F(xiàn)c受體的作用可能被低估了。由此，人們意識到了Fc功能的重要性，并開發(fā)了LALA技術(shù)。

抗體各亞型都有哪類Fc受體相結(jié)合？

人類有四種IgG抗體亞類，其中IgG1、IgG2和IgG4被用于治療性抗體。它們與至少三種不同類別的Fcγ受體相互作用，這些受體存在于免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞上，并且存在不同的亞型和等位型。

人類Fcγ受體的示意圖

其中，IgG1結(jié)合能力最強(qiáng)，能夠激活所有的人類Fcγ受體；IgG2主要與FcγRIIa相互作用，而IgG4則與FcγRI、FcγRIIa和FcγRIIb相互作用。此外，IgG1與補(bǔ)體成分C1q的結(jié)合能力也是最強(qiáng)的，并且能夠激活補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性（CDC）。

知識點(diǎn)補(bǔ)充小棧

不同IgG亞型在各方面的差異

結(jié)構(gòu)：IgG1和IgG4的鉸鏈區(qū)較短，結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定；IgG2的鉸鏈區(qū)更短，剛性更強(qiáng)；IgG3的鉸鏈區(qū)最長，含有額外的二硫鍵和重復(fù)序列，靈活性最高。

不同IgG亞型在分子量方面：IgG1、IgG2、IgG4的分子量約為150 kDa；IgG3約170 kDa。

效應(yīng)功能

ADCC：IgG1和IgG3與FcγRIIIa（CD16a）結(jié)合能力強(qiáng)，ADCC效應(yīng)顯著；IgG2和IgG4的ADCC效應(yīng)較弱。

CDC：IgG1和IgG3與C1q結(jié)合能力強(qiáng)，CDC效應(yīng)顯著；IgG2的CDC效應(yīng)較弱，IgG4幾乎無CDC效應(yīng)。

半衰期：IgG1、IgG2、IgG4的半衰期較長（約21天），因其與新生兒Fc受體（FcRn）結(jié)合能力強(qiáng)；IgG3的半衰期較短（約7天），因其與FcRn結(jié)合能力較弱。

生物學(xué)特性

IgG1：最常見的治療性抗體亞型，兼具強(qiáng)ADCC和CDC效應(yīng)，用于抗腫瘤、抗感染及自身免疫病治療（如利妥昔單抗、曲妥珠單抗）。

IgG2：ADCC和CDC效應(yīng)較弱，但穩(wěn)定性高，適合靶向細(xì)菌多糖抗原（如肺炎球菌疫苗），在抗炎和抗感染中應(yīng)用較多。

IgG3：ADCC和CDC效應(yīng)最強(qiáng)，但半衰期短且易聚集，臨床應(yīng)用較少，主要用于研究或特定感染性疾?。ㄈ绡懠玻?。

IgG4：ADCC和CDC效應(yīng)最弱，但抗炎作用顯著，適合需要減少免疫激活的場景，用于過敏性疾病治療（如奧馬珠單抗）或雙特異性抗體設(shè)計(jì)。

弱化ADCC效應(yīng)能力，除了IgG4，IgG2是否可以成為一種選擇呢？

IgG2因其較低的FcγR結(jié)合活性而具有“沉默”特性，但其二硫鍵交換導(dǎo)致的異質(zhì)性和較短的半衰期限制了其應(yīng)用。一種由IgG2的CH1結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)與IgG4的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域組成的嵌合抗體比單獨(dú)使用IgG2或IgG4更具“沉默”特性。這種構(gòu)建體已被用于4個INN藥物中，其中兩種已獲得市場授權(quán)，它們是依庫珠單抗（eculizumab）和拉武利珠單抗（ravulizumab）。

其他弱化ADCC的技術(shù)方法

除此之外，還有其他弱化ADCC效應(yīng)的手段。部分內(nèi)容已在之前的文章中有所提及。

• 無糖基化抗體通過去除Fc區(qū)域的N-連接糖基化位點(diǎn)，顯著降低了FcγR結(jié)合和免疫激活效應(yīng)，但仍存在部分殘留活性。盡管在臨床試驗(yàn)中顯示出一定的潛力，但其生產(chǎn)難度和穩(wěn)定性問題限制了其廣泛應(yīng)用。雙特異性T細(xì)胞接合劑（如mosunetuzumab和tarlatamab）盡管經(jīng)過無糖基化改造，仍可能引發(fā)嚴(yán)重的CRS，表明無糖基化并不能完全消除炎癥反應(yīng)。

  
  

• 通過下鉸鏈區(qū)突變（如L235E）來實(shí)現(xiàn)Fc沉默，也是減少抗體與FcγR結(jié)合的有效策略。盡管這類突變顯著降低了免疫激活效應(yīng)，但仍可能引發(fā)輸注相關(guān)反應(yīng)。

• 通過亞型間殘基交換（如E233P/L234V/L235A）和組合突變（如D265A），研究人員開發(fā)了更有效的Fc沉默抗體。盡管這些變體顯著降低了FcγR活性，但仍存在熱穩(wěn)定性降低和半衰期縮短等問題。

LALA家族

迄今為止，下鉸鏈區(qū)組合變體中使用最廣泛的是IgG1的L234A/L235A突變，通常稱為“LALA”。該突變完全消除了補(bǔ)體活性，并將與FcγRI和FcγRII的結(jié)合降低了100倍。而F234A/L235A仍然是IgG4中最受歡迎的變體。

LALA家族的擴(kuò)展

盡管LALA變體廣受歡迎，但I(xiàn)gG1的LALA變體并未完全沉默。它們顯示出與可溶性FcγRI和FcγRIIIa的158V等位基因的顯著結(jié)合，以及與除FcγRIIIa的158F等位基因外的所有受體的高水平ADCP（抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用）和ADCC（抗體依賴性細(xì)胞毒性）。此外，與野生型IgG1相比，突變的CH2結(jié)構(gòu)域熱穩(wěn)定性降低。因此，一些研究人員添加了額外的突變以使沉默更完全，并可能恢復(fù)熱穩(wěn)定性。

• 最早的方法之一是在下鉸鏈區(qū)添加額外突變，創(chuàng)建L234A/L235A/G237A變體。該變體成功消除了與FcγRI和FcγRIII的結(jié)合，并恢復(fù)了熱穩(wěn)定性，但矛盾的是，它增加了與FcγRIIa的131H等位基因和FcγRIIb的細(xì)胞激活。

• 之后，由研究人員將L234A/L235A/G237A與N297A結(jié)合。通過在下鉸鏈區(qū)添加突變到無糖基化抗體中，F(xiàn)c效應(yīng)功能被完全消除，但代價是穩(wěn)定性和聚集潛力顯著降低。

• 2000年和2001年，人類IgG1 Fc與FcγRIII可溶性結(jié)構(gòu)域復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)被發(fā)表。P329作為一個廣泛保守且重要的接觸殘基的鑒定，促使研究人員探索其提供更完全沉默的潛力。單點(diǎn)突變P329A或P329G消除了與C1q的結(jié)合，并將與所有Fc受體的結(jié)合降低了一個數(shù)量級。LALA與P329G的組合幾乎完全消除了與Fcγ受體的結(jié)合，且未檢測到ADCC。而LALA與P329A的組合效果較差。近年來，L234A/L235A/P329G變得越來越受歡迎。

LALA家族的更多遠(yuǎn)親

• 一種包含L235A/G237A突變的抗體在很大程度上消除了與FcγRI、FcγRIIIa和FcγRIIa的131R等位基因的結(jié)合，但仍保留了與131H等位基因和FcγRIIb的ADCP（抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用）活性。

• 有研究人員將L234F/L235E突變與P331S突變結(jié)合，但其表現(xiàn)不如其他變體，與所有這些受體結(jié)合時仍顯示出可測量的ADCP和ADCC水平，且熱穩(wěn)定性降低。

• L234F/L235E還可與D265A結(jié)合，應(yīng)用該技術(shù)的抗體藥物附有CRS風(fēng)險的黑框警告，51%的患者出現(xiàn)了CRS。L234F/L235E/D265A比L234F/L235E/P331S更完全沉默，但與野生型IgG1相比，熱穩(wěn)定性降低。

其他變體

通過結(jié)合多種突變（D265A/P331S和L235R/G236R/S239K/A327G/A330S/P331S），研究人員開發(fā)了更有效的Fc沉默抗體。盡管這些變體顯著降低了FcγR結(jié)合和補(bǔ)體活性，但仍可能存在殘留的ADCP活性。

一種具有更優(yōu)特性的新變體

下鉸鏈區(qū)是Fc沉默最常見的靶向位點(diǎn)，但許多改變會損害熱穩(wěn)定性。它也是對基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）降解最敏感的區(qū)域，可能導(dǎo)致生物活性喪失。

通過將234和235位點(diǎn)突變與G236R結(jié)合，研究人員發(fā)現(xiàn)了一組在所有結(jié)合或功能測定中完全沉默的變體——甚至超越了之前可用的變體，如L234A/L235A/P327G。其中最好的之一是L234S/L235T/G236R（“STR”）。它不僅完全沉默，其熱穩(wěn)定性至少與野生型IgG相當(dāng)（甚至更好），并且對基質(zhì)金屬蛋白酶的抵抗力也更強(qiáng)。世界衛(wèi)生組織已將該變體采納為Fc沉默的“金標(biāo)準(zhǔn)”。它不僅對人類IgG1有效，還對所有人類亞型以及小鼠、兔子和猴子的IgG有效，并能有效沉默與這些不同物種Fc受體的結(jié)合，使其在臨床前和臨床研究中特別有用。

Fc修飾是否會帶來免疫原性？

眾所周知，免疫球蛋白恒定區(qū)的單點(diǎn)突變可能具有免疫原性。盡管Fc修飾可能引發(fā)抗藥抗體反應(yīng)，但現(xiàn)有研究表明，大多數(shù)Fc沉默突變（如LALA和STR）在臨床應(yīng)用中未顯示出顯著的免疫原性。然而，許多其他因素也會影響免疫原性風(fēng)險，例如聚集。因此，通過計(jì)算機(jī)模擬和體外方法評估突變風(fēng)險，并結(jié)合差示掃描熒光法（DSF）篩選變體，可以進(jìn)一步降低免疫原性風(fēng)險。

使用哪種變體？

熟悉的“LALA”變體在與所有人類Fcγ受體的ADCP和ADCC中仍然具有活性。大多數(shù)其他變體以及野生型IgG2和IgG4具有與野生型IgG1相似的FcγRI和/或FcγRII受體的ADCP活性。只有兩種變體在所有功能測定中完全沉默：IgG1 L234A/L235A/P329G和IgG4 E233P/F234V/L235A/D265A。不幸的是，與野生型IgG1相比，這兩種變體的熱穩(wěn)定性顯著降低，大多數(shù)其他變體也是如此，特別是缺乏Fc糖基化的N297A和N297G。沉默的必要程度取決于多種因素：臨床適應(yīng)癥、抗體形式、靶抗原、劑量、給藥途徑等。

我們能從抗PD-1和抗PD-L1抗體中學(xué)到什么？

實(shí)驗(yàn)表明，與Fcγ受體的結(jié)合會削弱抗PD-1抗體的抗腫瘤活性，但會增強(qiáng)抗PD-L1抗體的抗腫瘤活性。

通過直接比較一種具有野生型IgG4 Fc（可結(jié)合FcγRI和FcγRII）的抗PD-1抗體和一種具有E233P/F234V/L235A/D265A突變（完全沉默結(jié)合）的抗PD-1抗體。沉默抗體在體外表現(xiàn)出阻斷活性，而野生型抗體則具有激活作用。

抗體學(xué)會列出了18種已獲批用于臨床或正在接受監(jiān)管審查的抗PD-1抗體。其中包括四種具有“沉默”突變的IgG1（LALA或LALA加G237A），13種野生型IgG4（帶有S228P以穩(wěn)定結(jié)構(gòu)）和替雷利珠單抗。

在這一免疫檢查點(diǎn)軸的另一端，抗體學(xué)會列出了10種已獲批或正在審查的抗PD-L1抗體。其中包括四種野生型IgG1，一種野生型IgG4和五種不同的Fc變體。

其他免疫刺激性抗體

除了PD-1和PD-L1，其他還有針對CD47、CD40和4-1BB等的抗體。對于像PD-1或LAG-3這樣的抑制性受體，選擇完全Fc沉默的拮抗劑是一種趨勢。

ADC與LALA技術(shù)

據(jù)估計(jì)，ADC通常只有大約0.1%被腫瘤吸收——其余的ADC去了哪里？嚴(yán)重的副作用，包括淋巴細(xì)胞減少癥、中性粒細(xì)胞減少癥、血小板減少癥和神經(jīng)病變，在所有ADC中都很常見。至少其中一些非靶向效應(yīng)可能是由Fcγ和/或FcRn受體介導(dǎo)的細(xì)胞攝取引起的，而Fc沉默將提供更可靠的解決方案。

總結(jié)

很多時候，選擇缺乏科學(xué)依據(jù)，知識產(chǎn)權(quán)是重要的影響因素之一。Fc修飾的專利格局復(fù)雜，截至2019年，IgG4抗體專利被總結(jié)，其他亞類未有類似分析。LALA家族中有效沉默突變（如L234A/L235A/P329G、L234F/L235E/D265A）專有，使用受限于所有者，其他變體專利申請仍在進(jìn)行。這可能促使一些人探索Fc領(lǐng)域的奇特區(qū)域。STR變體可能已達(dá)到既完全又不損害Fc區(qū)域結(jié)構(gòu)完整性的Fcγ沉默極限，但抗體工程研究人員仍有很大發(fā)揮空間。

總之，LALA 技術(shù)是一種重要的抗體工程方法，通過對 Fc 區(qū)域的精準(zhǔn)改造，調(diào)控抗體的免疫功能。它在提高抗體藥物的安全性、有效性和特異性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，為治療多種疾病提供了新的可能性。

參考資料|DOI: 10.1111/imr.13379

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