▎藥明康德內(nèi)容團(tuán)隊(duì)編輯

許多疾病的發(fā)生與異常的基因突變有關(guān)，當(dāng)突變發(fā)生在基因外顯子區(qū)域時(shí)，會(huì)直接導(dǎo)致基因編碼的蛋白序列紊亂，產(chǎn)生的蛋白可能功能失調(diào)或造成細(xì)胞毒性。通常情況下，科學(xué)家會(huì)嘗試清除或中和掉已經(jīng)形成的有害蛋白，來減輕疾病嚴(yán)重程度；此外，另一項(xiàng)策略則是直接對(duì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的DNA片段進(jìn)行編輯和修改，讓蛋白編碼重回正軌。

來自伊利諾伊大學(xué)厄巴納-香檳分校的Pablo Perez-Pinera教授長期致力于基因編輯相關(guān)的研究，但與直接改變錯(cuò)誤序列的常規(guī)方式不同，他與同事認(rèn)為跳過錯(cuò)誤的外顯子區(qū)域或許同樣具備治療潛力。Perez-Pinera教授用做菜作了一個(gè)比喻：當(dāng)菜譜上出現(xiàn)一個(gè)材料錯(cuò)誤時(shí)，直接按配方做可能會(huì)產(chǎn)生奇怪的味道甚至有毒；但如果只是跳過這種材料，食物最終只是缺乏了某種風(fēng)味但仍可食用。

圖片來源： 123RF

在近期的《自然-通訊》雜志上，Perez-Pinera教授和同事就展示了這樣一種特殊的基因編輯工具SPLICER，它在CRISPR/Cas9的基礎(chǔ)上改造而來，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)特定外顯子的直接跳躍。研究在阿爾茨海默病致病相關(guān)基因——淀粉樣前體蛋白（APP）編碼基因上對(duì)SPLICER的效果進(jìn)行了測試，結(jié)果顯示SPLICER可以有效減少毒性淀粉樣β蛋白生成，并且沒有產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。在經(jīng)過處理的小鼠體內(nèi)，目標(biāo)外顯子水平減少了25%。

根據(jù)論文介紹，在CRISPR/Cas9編輯工具中，與目標(biāo)DNA序列相鄰的一小段DNA序列被稱作原間隔序列鄰近模塊序列（PAM），它對(duì)于Cas9蛋白識(shí)別靶序列很關(guān)鍵。但同時(shí)，過度依賴PAM來實(shí)現(xiàn)編輯功能，也在一定程度上限制了CRISPR/Cas9在更多外顯子場景中發(fā)揮作用。

在新研究中，作者對(duì)各種更新版本的Cas9酶進(jìn)行了測試和分析，他們挑選了一類SpRY Cas9酶。相較于野生型Cas9，這種酶的優(yōu)勢是對(duì)PAM的依賴度很低，可以編輯更多數(shù)量的靶標(biāo)。

▲SPLICER可以實(shí)現(xiàn)更高效的外顯子跳躍（圖片來源：參考資料[1]）

此外，在外顯子起始兩端分別存在一個(gè)關(guān)鍵序列區(qū)域，能夠保證細(xì)胞自體的基因機(jī)制來判斷外顯子的位置。過往的外顯子跳躍工具通常會(huì)靶向其中一個(gè)序列，這樣可能會(huì)遺漏掉一些目標(biāo)外顯子，或者沒有完整地實(shí)現(xiàn)跳躍。而SPLICER則可以同時(shí)靶向外顯子起始兩端的序列，有效提升了外顯子跳躍效率。作者測試了SPLICER在數(shù)個(gè)外顯子中的效果，以JAG1外顯子為例，與只靶向外顯子一側(cè)序列相比，SPLICER的外顯子跳躍率提升了28%~37%。

隨后，研究進(jìn)一步探索了SPLICER在疾病場景下的應(yīng)用價(jià)值，他們關(guān)注了與阿爾茨海默病發(fā)生密切相關(guān)的APP基因，并選擇性地跳過了APP的外顯子17。通常情況下，APP蛋白會(huì)被β/γ分泌酶處理生成Aβ42多肽，而這個(gè)切割位點(diǎn)恰好位于APP外顯子17區(qū)域。

根據(jù)分析結(jié)果，SPLICER同樣可以比單獨(dú)靶向工具更有效地跳躍APP外顯子17，同時(shí)SPLICER可以將異常剪接事件減少50%以上，避免過早出現(xiàn)終止密碼子，或部分保留內(nèi)含子的不利影響。此外，SPLICER可以使細(xì)胞中的Aβ42水平下降約70%。在AD模型小鼠中，作者借助腺相關(guān)病毒載體將SPLICER注射到了小鼠的海馬體中，這種方式可以使APP外顯子17減少約25%，有效減少了Aβ42多肽在海馬體中的產(chǎn)生。

研究團(tuán)隊(duì)總結(jié)道，外顯子跳躍可以在新產(chǎn)生的蛋白仍然維持功能的情況下使用。對(duì)于阿爾茨海默病、帕金森病，這種方法具有很大的治療潛力，可以幫助避免有害蛋白在大腦中過度累積。

參考資料：

[1] Miskalis, A., Shirguppe, S., Winter, J. et al. SPLICER: a highly efficient base editing toolbox that enables in vivo therapeutic exon skipping. Nat Commun 15, 10354 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54529-y

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