近日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院、果蔬園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和湖北洪山實(shí)驗(yàn)室程運(yùn)江教授課題組在The Plant Journal發(fā)表了題為“Transcription factor CitMYB16 positively regulates cutin and wax biosynthesis in citrus by directly activating CitDCR and CitKCS2”的研究論文。該研究系統(tǒng)解析了CitMYB16在柑橘果實(shí)角質(zhì)層形成中的關(guān)鍵作用，揭示其通過(guò)激活CitDCR和CitKCS2，調(diào)控角質(zhì)與蠟質(zhì)合成的分子機(jī)制。該研究不僅拓展了果實(shí)角質(zhì)層形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也為提升柑橘果實(shí)抗逆性和貯藏保鮮性能提供了理論依據(jù)。

角質(zhì)層是植物抵御外界生物和非生物脅迫的重要屏障，主要由角質(zhì)和蠟質(zhì)組成，在降低果實(shí)失水、減少果實(shí)裂果和抵御病原侵染等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。然而，受限于角質(zhì)層分離體系的復(fù)雜性以及缺乏理想研究材料，柑橘果實(shí)角質(zhì)層的形成機(jī)制及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍不清晰。

為尋找適合研究柑橘角質(zhì)層形成的材料，本研究比較了9個(gè)柑橘品種果實(shí)的角質(zhì)與蠟質(zhì)組分，發(fā)現(xiàn)枳（Citrus trifoliata, ZK）及其雜交種枳橙和枳柚的角質(zhì)和蠟質(zhì)含量均顯著高于紅橘（Citrus reticulata, HJ）和溫州蜜柑（Citrus unshiu Marc; WZMG）等寬皮柑橘類(lèi)。枳果實(shí)的角質(zhì)和蠟質(zhì)含量分別是紅橘的15.54倍和10.48倍，其中高含量的9/10,16雙羥基十六烷酸可能是導(dǎo)致枳角質(zhì)含量遠(yuǎn)高于紅橘的關(guān)鍵代謝物。

圖1 9個(gè)柑橘品種的角質(zhì)層組分分析

為深入解析角質(zhì)單體9/10,16雙羥基十六烷酸在枳中高度積累的分子機(jī)制，團(tuán)隊(duì)結(jié)合加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）和相關(guān)性分析，鑒定出與角質(zhì)層形成密切相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子CitMYB16，其在枳果實(shí)中的表達(dá)水平顯著高于紅橘。通過(guò)柑橘果實(shí)的瞬時(shí)過(guò)表達(dá)、病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)化番茄，發(fā)現(xiàn)CitMYB16不僅促進(jìn)角質(zhì)積累，同時(shí)也促進(jìn)蠟質(zhì)合成，具備雙重調(diào)控能力（圖2）。

圖2 角質(zhì)層關(guān)鍵基因的挖掘與功能驗(yàn)證

隨后，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)初步篩選出5個(gè)可能受CitMYB16調(diào)控的下游靶基因（CitCER1-3、CitCER2、CitKCS2、CitGPAT6和CitDCR）；酵母單雜交實(shí)驗(yàn)表明，CitMYB16僅與CitDCR和CitKCS2的啟動(dòng)子存在相互作用。對(duì)靶基因啟動(dòng)子中預(yù)測(cè)的MYB結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，結(jié)合電泳遷移率分析（EMSA）和染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP-qPCR）等實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CitMYB16可直接結(jié)合并激活CitDCR和CitKCS2的啟動(dòng)子，從而正向調(diào)控其表達(dá)（圖3）。

圖3 CitMYB16直接結(jié)合并激活CitDCR和CitKCS2的啟動(dòng)子。

進(jìn)一步通過(guò)柑橘果實(shí)的瞬時(shí)過(guò)表達(dá)、VIGS以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)化番茄，證實(shí)CitDCR參與角質(zhì)單體9/10,16雙羥基十六烷酸的合成，調(diào)控角質(zhì)積累；在擬南芥中異源過(guò)表達(dá)CitKCS2促進(jìn)葉片蠟質(zhì)積累，尤其是烷烴類(lèi)蠟質(zhì)含量顯著升高（圖4）。

圖4 下游靶基因CitDCR和CitKCS2的功能驗(yàn)證

該研究系統(tǒng)驗(yàn)證了CitMYB16、CitDCR和CitKCS2在柑橘果實(shí)角質(zhì)層形成中的重要功能，揭示了轉(zhuǎn)錄因子CitMYB16通過(guò)直接激活CitDCR和CitKCS2的表達(dá)，協(xié)同調(diào)控角質(zhì)與蠟質(zhì)合成的作用機(jī)制。該研究不僅深化了對(duì)果實(shí)角質(zhì)層形成及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理解，也為提升柑橘果實(shí)抗逆性與貯藏保鮮性能提供了重要的理論支撐與關(guān)鍵基因資源。

圖5 CitMYB16調(diào)控柑橘角質(zhì)和蠟質(zhì)合成的分子機(jī)制

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院、果蔬園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室博士后朱智鋒為論文第一作者，程運(yùn)江教授為通訊作者。在讀博士生盧麗麗、李瑞雪及已畢業(yè)的博士生楊宏賓等共同參與了本項(xiàng)研究。朱峰教授和德國(guó)馬克斯·普朗克分子植物生理所Alisdair Fernie教授為本研究提供了重要指導(dǎo)。該研究依托華中農(nóng)業(yè)大學(xué)果蔬園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)，得到了國(guó)家自然科學(xué)基金國(guó)際(地區(qū))合作與交流項(xiàng)目、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)柑橘產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系、湖北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃以及湖北省洪山實(shí)驗(yàn)室基金等項(xiàng)目的資助。

https://doi.org/10.1111/tpj.70324