小師妹

這稿件直接決定我是否按時(shí)畢業(yè)，可審稿人反饋說(shuō)里面的 WB 數(shù)據(jù)可信度不足，這條帶那么清晰，為什么被質(zhì)疑真實(shí)性？

你的內(nèi)參和目標(biāo)蛋白的信號(hào)是不是沒(méi)在同一張膜上？

大師兄

小師妹

分子量有差異，肯定要裁膜并分步孵育抗體，同一張膜上呈現(xiàn)信號(hào)，這不是為難我嗎？

我們可以用雜志推薦的總蛋白歸一化，全膜同時(shí)檢測(cè)目的蛋白和總蛋白，無(wú)需染色就可以獲取目的蛋白表達(dá)差異，還不用擔(dān)心內(nèi)參跑不齊。如果不做，可能會(huì)出現(xiàn)系統(tǒng)性偏差，導(dǎo)致生物學(xué)結(jié)論誤判，審稿人自然會(huì)質(zhì)疑結(jié)果的可靠性。

大師兄

隨著期刊雜志對(duì) WB 數(shù)據(jù)的要求越來(lái)越嚴(yán)格，提供帶 marker 的全膜圖像已逐漸變成數(shù)據(jù)提交的基本要求。大部分期刊如

Nature、Cell、JBC、J CELL BIOCHEM

為什么要做歸一化計(jì)算？

WB 實(shí)驗(yàn)涵蓋樣本制備、上樣電泳、轉(zhuǎn)印封閉到孵育成像等環(huán)節(jié)，通常需 1~2 天才能獲得可分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)人員的操作習(xí)慣與環(huán)境條件均可能對(duì)最終結(jié)果產(chǎn)生顯著影響（如圖1）。

圖1. 不同實(shí)驗(yàn)人員使用同一樣品進(jìn)行 WB 實(shí)驗(yàn)定量分析

圖 1 所示為三位實(shí)驗(yàn)人員使用同一樣品獲得的 WB 結(jié)果，Cy3（綠色）為目標(biāo)蛋白，Cy5（紅色）為總蛋白。在同一張膜上，直接使用 Cy3 目標(biāo)蛋白信號(hào)計(jì)算，不同泳道間 CV 值 >6%。利用 Cy5 進(jìn)行歸一化后 CV 值由最大 9.8% 降低至 5%。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)中需依賴(lài)參比數(shù)據(jù)才能提高定量準(zhǔn)確性。

總蛋白歸一化的必要性

WB 實(shí)驗(yàn)中，傳統(tǒng)內(nèi)參常選用看家蛋白（如 GAPDH、β-Actin、Tubulin），其理想特性為不受實(shí)驗(yàn)及病理?xiàng)l件影響的內(nèi)源性穩(wěn)定表達(dá)。但大量文獻(xiàn)證實(shí)，在組織差異、細(xì)胞應(yīng)激、藥物處理、疾病模型等多種實(shí)驗(yàn)條件下，這類(lèi)蛋白的表達(dá)水平會(huì)顯著波動(dòng)。例如，缺氧、代謝紊亂等病理?xiàng)l件可誘導(dǎo) β-actin 表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞周期同步化處理會(huì)導(dǎo)致 GAPDH 表達(dá)不穩(wěn)。

鑒于傳統(tǒng)內(nèi)參的局限性，基于泳道總蛋白信號(hào)進(jìn)行參比計(jì)算的「總蛋白歸一化」方法，逐漸獲得科研領(lǐng)域認(rèn)可，例如《

Journal of Biological Chemistry

圖 2. JBC 雜志對(duì)歸一化計(jì)算的方法要求

以 CHO 細(xì)胞裂解液樣品為例，梯度稀釋后進(jìn)行 2 次重復(fù)上樣，計(jì)算 ERK1/2 蛋白分別使用總蛋白、看家蛋白 Tubulin、Actin、GAPDH 進(jìn)行歸一化時(shí)的變異系數(shù) CV 值（圖 3.4）。

圖 3. 總蛋白歸一化結(jié)果

圖 4. 看家蛋白歸一化結(jié)果

最終統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，總蛋白歸一化后的 CV 值僅 7%，而看家蛋白普遍 >10%。使用總蛋白歸一化的方式可以有效降低上樣差異和內(nèi)參蛋白表達(dá)差異，有利于獲得更真實(shí)的表達(dá)量變化。

如何做蛋白歸一化計(jì)算？

1、樣品標(biāo)記

Cytiva Amersham Quick Stain（貨號(hào)：RPN 4000）總蛋白檢測(cè)試劑盒以 40 ul WB 實(shí)驗(yàn)體積為例：

1. 19 ul 樣品裂解液+1 ul Cy5 染料工作液混勻；

2. 室溫孵育 3-30 分鐘；

3. 加入 20 ul 2xLoading buffer 混勻；

4. 95 ℃ 加熱 3 分鐘后短暫離心準(zhǔn)備電泳上樣；

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2、印跡膜選擇指南

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3、封閉孵育

Amersham ECL 封閉劑

每包含 40 g 封閉試劑，可完成 >20 次的小量封閉實(shí)驗(yàn)，與 ECL 檢測(cè)試劑配合使用效果更佳。

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Amersham ECL HRP 偶聯(lián)二抗

具有高種屬特異性，與 ECL 檢測(cè)試劑配合使用，可以最優(yōu)稀釋比例獲得更低背景。

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Amersham ECL Plex CyDye 偶聯(lián)二抗

它是 ECL Plex、Cy3 及 Cy5 偶聯(lián)的抗體，利用 CyDye 熒光標(biāo)記，可進(jìn)行多波長(zhǎng)掃描，無(wú)需 Stripping 和 Reprobing，減少誤差，高特異性檢測(cè)蛋白。

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Amersham CyDye NIR 二抗

Amersham CyDye 700 和 800 二抗標(biāo)記有 NIR熒光團(tuán)，可發(fā)射 700 nm 或 800 nm 波長(zhǎng)的光。Amersham cyDye 700 和 800 二抗與一對(duì)合適的免或小鼠一抗配合使用，可以實(shí)現(xiàn)多重實(shí)驗(yàn)。

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4、成像

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5、分析

IQTL-Blot Analysis

1. 打開(kāi)需要分析的圖片；

2. 泳道識(shí)別、背景扣除、條帶識(shí)別（目的蛋白）；

3.在均一化中方法選擇 Total Protein，參比通道選擇熒光，均一化因子選擇 Total Lane Volume；

4. 以柱狀圖或表格形式展示，結(jié)果以圖片、PDF 報(bào)告或文檔形式導(dǎo)出。

內(nèi)容策劃：王丹琦

內(nèi)容審核：周育紅

題圖及文中圖片來(lái)源：Cytiva 思拓凡