個(gè)人工作多年以后再回來(lái)讀博的，所以實(shí)驗(yàn)技術(shù)什么的從頭學(xué)起，這其中 WB 走的彎路最多，現(xiàn)在就和大家聊聊我個(gè)人的歷程，并交流一下自己的經(jīng)驗(yàn)。這個(gè)經(jīng)驗(yàn)是我跑一個(gè) 11KD 分子量分泌性蛋白得出的，肯定不會(huì)適用于所有情況，但是受困于小分子量蛋白 WB 的朋友還是很多，所以聊勝于無(wú)，在此分享一下。

我搞的蛋白質(zhì)是一個(gè) 11KD 的分泌性蛋白，并且是我實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中一個(gè)重要的指標(biāo)，最初學(xué)習(xí) WB 技術(shù)，受困于二抗不合格一直連內(nèi)參都做不出來(lái)......后面改換抗體之后，才相對(duì)順利一點(diǎn)，其他指標(biāo)也相繼出來(lái)了。所以，抗體真的很重要。

但是在做 WB 實(shí)驗(yàn)的 7、8 個(gè)月過(guò)程中，核心的一個(gè)蛋白一直處于混沌狀態(tài)，可能跑 30 次能現(xiàn)身一次，現(xiàn)身之后又沒影好幾個(gè)月，就這樣捉摸不定，搞得我很煩，但又無(wú)可奈何。詢問(wèn)了實(shí)驗(yàn)室的同學(xué)們，說(shuō)法各一：

1、有人說(shuō)小分子量蛋白就是難跑，為什么難大家也說(shuō)不清楚。

2、有的說(shuō)分泌性蛋白本身胞內(nèi)含量少，不好跑，需要加大上樣量，似乎也是實(shí)話。

3、還有的說(shuō)小分子量蛋白容易降解，你的蛋白質(zhì)降解了吧，我姑且信了。但是 95% 的時(shí)候我跑出的條帶都是大白板，縱然我通過(guò) PCR、細(xì)胞的免疫熒光都能夠發(fā)現(xiàn)這個(gè)蛋白，但是就是 WB 做不出來(lái)。

4、也有朋友告訴我說(shuō)分泌型蛋白你還是做 ELISA 吧，可是一來(lái)這個(gè)蛋白的 ELISA 試劑盒好貴的，二來(lái)我就是想做 WB。所以就開始了上下求索之路。95% 的時(shí)間跑出來(lái)的條帶是這樣的……

（圖：實(shí)驗(yàn)條帶）

這一求索就是幾個(gè)月的時(shí)間。期間一直覺得電泳沒什么技術(shù)含量，電轉(zhuǎn)的過(guò)程才是重點(diǎn)，于是糾結(jié)于電轉(zhuǎn)條件，也糾結(jié)過(guò)電轉(zhuǎn)液的配置等。再次翻閱丁香園論壇里面大神的回帖，其中一個(gè)大神提到：小分子量蛋白容易在電泳過(guò)程中彌散，電泳在壓縮膠里多壓一會(huì)，在分離膠里面跑一半就好了。對(duì)這個(gè)話百思不得其解，于是開始查詢一些實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面的文獻(xiàn)，其中有幾篇文獻(xiàn)對(duì)我很有啟發(fā)，有些技術(shù)原理方面的內(nèi)容如下：

在含 SDS 緩沖液的樣品中，小分子多肽的濃縮是較困難的，因?yàn)樾》肿佣嚯呐c SDS 形成的復(fù)合體具有與 SDS 本身類似的電荷和大小，所以偏離了相對(duì)遷移率和分子質(zhì)量對(duì)數(shù)的相互關(guān)系，因此濃縮對(duì)于小分子多肽的 SDS-PAGE 來(lái)說(shuō)就成了一個(gè)突出問(wèn)題。

于是回去翻了翻自己曾經(jīng)偶然跑出來(lái)的條帶的模樣，給我的感覺就是壓縮的不好，然后還有彌散的現(xiàn)象（就是那種蛋白暈開的模樣，例如這條帶下面的波浪邊緣，當(dāng)然也可能是膠不均勻的原因吧，反正我當(dāng)時(shí)就覺得是彌散的現(xiàn)象）。

（圖：實(shí)驗(yàn)條帶）

然后我就突然有種恍然大悟的感覺，也許說(shuō)的不對(duì)，但是我個(gè)人的感覺是：

一般較大的分子量的蛋白（如 20-70KD）與上樣緩沖液中的 SDS 結(jié)合后，因?yàn)楸旧淼鞍追肿哟?，SDS 附著在上面之后，還是和膠里面的 SDS 成分有較大差異的，那么在一定電流方向的作用下，就能夠順著電流方向向下電泳；而小分子蛋白被 SDS 包裹結(jié)合形成復(fù)合物后，因?yàn)榈鞍追肿有?，包裹?SDS 后就和膠里面本身的 SDS 差別沒那么大了，那么此時(shí)就算有電流作用，它也不會(huì)那么聽話的順流而下，畢竟和周遭的膠里面的 SDS 區(qū)別不大，在電泳向下走的過(guò)程中，可能向其他方向混亂的運(yùn)動(dòng)，走著走著就暈染開了，就像墨點(diǎn)到宣紙上一樣。

所以回到前面大神說(shuō)的話，讓多壓一會(huì)，那么就是為了讓小分子蛋白盡量聚集；少電泳一會(huì)，就是稍微跑開 marker 之后，能夠分開小分子蛋白和內(nèi)參即可，加入跑多了，例如溴酚藍(lán)跑到下沿 1 cm 以上的位置，那時(shí)候可能小分子蛋白就又暈染開消失在膠里面了，這樣的話一抗也就不能識(shí)別那么彌散的蛋白了。（專業(yè)人士原諒我粗淺的認(rèn)識(shí)哈，也許不對(duì)，但是我理解的就是這樣，我就是打個(gè)比方讓其他的科研小白能理解。）

然后在論壇里面還看到一個(gè)建議就是用 0.2% 的戊二醛固定轉(zhuǎn)膜完成后的條帶 45 分鐘，再進(jìn)行后續(xù)封閉漂洗等步驟，為的就是防止小分子蛋白在后續(xù)操作中洗脫了。于是乎說(shuō)干就干，開始了我再次改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)歷程，說(shuō)來(lái)簡(jiǎn)單，實(shí)際上從 25 號(hào)到 1 號(hào)，一共 8 天時(shí)間，我大概做了 12 次 WB，終于能夠重復(fù)出來(lái)結(jié)果了。要點(diǎn)如下：

1、電轉(zhuǎn)液中一定不要加 SDS。對(duì)于大分子量蛋白加入 SDS 是為了增加轉(zhuǎn)膜效率，道理上是增加了蛋白表面電荷。而對(duì)于小分子量蛋白，SDS 千萬(wàn)不能加，否則會(huì)封閉小分子蛋白的抗原位點(diǎn)。（我忘記從哪里看到的了，文獻(xiàn)不能在這里給出，大家勿吐槽我哈。）

2、從最開始糾結(jié)于電轉(zhuǎn)過(guò)程，使勁摸索電轉(zhuǎn)條件，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)電泳過(guò)程同樣很重要啊。電轉(zhuǎn)的時(shí)候其實(shí)只要預(yù)染 marker 轉(zhuǎn)到膜上了，那么你相應(yīng)分子量的目的蛋白也就轉(zhuǎn)過(guò)去了，所以這就是你摸索條件的指示帶。

3、電泳過(guò)程中有推薦 TRICINE-SDS-PAGE 膠來(lái)進(jìn)行電泳，會(huì)更有利于小分子量蛋白的分離，研讀了一些文獻(xiàn)，這個(gè)效果應(yīng)該還是很肯定的，但是鄙人沒有做過(guò)這種電泳，所以給不了什么經(jīng)驗(yàn)，我最終還是用普通 SDS-PAGE 膠做出來(lái)的，不過(guò)鑒于我的蛋白分子量是 11KD，那么假如你是幾 KD 甚至更小分子量的多肽，那么還是建議你用 TRICINE-SDS-PAGE 膠來(lái)電泳吧。

4、在我用 SDS-PAGE 膠進(jìn)行電泳過(guò)程中，一直以來(lái)都是按照說(shuō)明書配制壓縮膠和分離膠的，并且在說(shuō)明書中，以配置 2 塊膠為例，分離膠說(shuō)明書中是讓配置 10 ml，壓縮膠是 3 ml。我一直以為是對(duì)應(yīng)關(guān)系，在這次大悟之后我發(fā)現(xiàn)分離和壓縮完全不是一對(duì)一對(duì)應(yīng)關(guān)系，人家只是給了你配置這么多體積膠的配方而已，雖然在一個(gè)縱列上，但是絕不是對(duì)應(yīng)關(guān)系。（我確實(shí)才覺悟，高手輕鄙視哈。）

5、接上一條經(jīng)驗(yàn)，所以我在配膠過(guò)程中，下層分離膠配制了 10 ml，但是實(shí)際上每塊玻板里面只加了大概 3.5 ml 吧，也就是整個(gè)玻板高度的 60-70% 的樣子。然后壓縮膠配了 6 ml，玻板填滿插梳子，等凝固。這里我就是想讓我的小分子蛋白盡量在濃縮膠里面多濃縮、壓扁，這樣后續(xù)再分離膠里面，即使彌散一些，也總還有剩下的。

6、電泳開始，在濃縮膠層里面跑的時(shí)候，我是 60-70V 電壓，跑了大概快一個(gè)小時(shí)，反正就是溴酚藍(lán)都集中在上下層膠的那個(gè)界面的位置，并且在界面那里好半天都不動(dòng)了，那么這個(gè)過(guò)程我理解就是小分子量蛋白雖然表面電荷和膠里面的 SDS 相當(dāng)，但是終究還是會(huì)沿著電流方向定向移動(dòng)的，所以就多壓一會(huì)吧。然后開始調(diào)整電壓為 110-120V 在分離膠里面跑，我是跑到分離膠一半的位置就停止電泳了，這時(shí)候 marker 已經(jīng)分開一些了。

7、接上一條，marker 分開了一些，但是實(shí)話說(shuō)分的并不好，你如果想同時(shí)測(cè)好幾個(gè)蛋白指標(biāo)是很困難的，不好切膠，也不好敷條帶，所以我的建議，小分子蛋白就單獨(dú)出來(lái)跑吧。

8、電泳完成后，開始電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)過(guò)程我試過(guò) 90V 恒壓 60 分鐘，也試過(guò) 250ma 恒流 15 分鐘，對(duì)于我的蛋白都能得到滿意結(jié)果。

9、轉(zhuǎn)膜后條帶是否必須戊二醛固定？經(jīng)過(guò)我的嘗試，對(duì)于我的 11KD 蛋白來(lái)說(shuō)固定不固定沒有影響，那么即使固定了，戊二醛也不會(huì)影響后續(xù)的抗原抗體反應(yīng)。所以各位同學(xué)們固定不固定隨意吧，假如你的蛋白分子量很小，也許 5KD 以下？那么固定一下也未嘗不可。

10、抗原抗體反應(yīng)很靈敏，我的抗體在免疫熒光上面已經(jīng)驗(yàn)證過(guò)的，所以敷抗體的過(guò)程沒什么說(shuō)的。不過(guò)抗體稀釋比例的話，我是習(xí)慣提高濃度的，說(shuō)明書 1：1000，我就 1：500。這個(gè)沒有依據(jù)，純癖好，也是師兄們教的。

11、顯影這一步我覺得也有可說(shuō)的。我試過(guò)多次，發(fā)現(xiàn)我的這個(gè)蛋白第一遍滴加顯影液后條帶不會(huì)很清晰，然后你可以把條帶拿出來(lái)就放一邊讓它反應(yīng)一會(huì)，然后再放回機(jī)器里面，重新滴加顯影液顯影，效果就會(huì)好不少。還有顯影時(shí)間，結(jié)合我的示例，機(jī)器給出的自動(dòng)曝光時(shí)間是 30 幾秒，我就直接加 1 分鐘改為 1 分 30 幾秒，然后就得到了下面的條帶。

第一遍顯影條帶，可以看到模糊有東西，但是不清楚，于是我拿出來(lái)放一邊反應(yīng)一下。

（圖：實(shí)驗(yàn)條帶）

反應(yīng)幾分鐘后，我再把條帶放進(jìn)機(jī)器，時(shí)間上直接增加 1 分鐘，再滴加新的顯影液，是不是好了很多。

（圖：實(shí)驗(yàn)條帶）

到這里我就總結(jié)完了我的經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)。當(dāng)然這 7、8 個(gè)月的摸索，還有很多想說(shuō)的，但是限于篇幅和敘事能力有限，就大致總結(jié)了幾條，有些啰嗦，見諒。希望對(duì)還被小分子量蛋白 WB 折磨的朋友們有幫助。

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