骨質(zhì)疏松癥（OP）是一種臨床常見的骨骼疾病，其破骨細(xì)胞（OCs）過度活化會顯著延緩骨再生進(jìn)程。在此背景下，骨再生不僅需要促進(jìn)成骨與抑制骨吸收，還對血管化（尤其是H型血管）提出了更嚴(yán)格的要求。近年來，鍶（Sr）作為"雙效骨劑"既能促進(jìn)骨形成又可抑制骨吸收，卻仍未獲得足夠重視。鑒于破骨前體細(xì)胞（pOCs）分泌的PDGF-BB能在成骨耦合過程中誘導(dǎo)H型血管形成，Sr2+對破骨細(xì)胞生成的調(diào)控作用亟需在血管化骨再生領(lǐng)域深入研究與應(yīng)用。

來自中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)的董世武等團(tuán)隊(duì)通過用Sr2+部分取代層狀雙氫氧化物（LDH）中的二價(jià)金屬離子，合成了鍶取代LDH（Sr-LDH），并將表面修飾的Sr-LDH封裝至含有QK肽的甲基丙烯?；髂z（GelMA）中，形成復(fù)合水凝膠GelMA-QK/Sr-LDH@PDA（GLQ）。這種多功能水凝膠整合了Sr-LDH的促成骨與抗吸收特性，在骨質(zhì)疏松條件下展現(xiàn)出顯著的骨再生功效。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GLQ能刺激骨髓源性巨噬細(xì)胞（BMMs）增殖并維持pOCs群體，同時(shí)抑制OC成熟分化，從而促進(jìn)PDGF-BB表達(dá)并推動(dòng)骨缺損區(qū)H型血管發(fā)育。該多功能復(fù)合水凝膠為未來骨質(zhì)疏松性骨缺損治療提供了重要臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值。相關(guān)工作以題為“Strontium-loaded multifunctional gelatin methacryloyl hydrogels for type-H vascularized bone regeneration under osteoporotic conditions”的文章發(fā)表在2025年05月29日的期刊《Materials Today Bio》。

【材料的合成與表征】

LDH與Sr-LDH的SEM和TEM結(jié)果如圖1A、B所示，二者均呈現(xiàn)納米層狀結(jié)構(gòu)。值得注意的是，Sr的引入并未阻礙LDH納米層狀結(jié)構(gòu)的形成。通過PDA氧化自聚合對Sr-LDH進(jìn)行表面修飾后，獲得的Sr-LDH@PDA經(jīng)TEM觀察顯示，PDA修飾未改變Sr-LDH的晶體結(jié)構(gòu)。DLS分析表明，PDA表面修飾雖使Sr-LDH納米片的尺寸略有增加，但顯著提升了其分散性。這一改進(jìn)對實(shí)現(xiàn)水凝膠基質(zhì)中的均勻分散至關(guān)重要，從而為Sr2?的長期緩釋奠定了理想基礎(chǔ)。本文通過EDS與ICP對LDH及Sr-LDH的元素組成進(jìn)行定性與定量分析。如圖1C、D所示，EDS結(jié)果證實(shí)Sr成功摻入LDH結(jié)構(gòu)并均勻分布，形成Sr-LDH。基于LDH化學(xué)組成的可調(diào)控性，本研究采用共沉淀法將Sr2?引入LDH，因其與Mg2?價(jià)態(tài)相同，故部分取代Mg2?制備出Sr-LDH。ICP定量分析顯示，Sr2?部分取代Mg2?后，Sr-LDH中Mg:Sr比例約為6:1。

不同GelMA水凝膠的SEM圖像如圖1E所示。結(jié)果表明，本研究制備的GelMA水凝膠具有大孔徑多孔結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞黏附與生長。這種大孔結(jié)構(gòu)模擬了體內(nèi)微環(huán)境，使細(xì)胞能在三維環(huán)境中生長，同時(shí)促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)/調(diào)控因子的運(yùn)輸、代謝產(chǎn)物的排泄及細(xì)胞間通訊。需特別指出的是，學(xué)界普遍認(rèn)為多孔水凝膠能促進(jìn)血管化及新生骨組織形成。

圖1 材料的形貌與組分表征

圖2A展示了水凝膠樣品的典型照片，所有圓柱狀水凝膠直徑約5毫米、高度約2毫米。本文系統(tǒng)評估了不同GelMA水凝膠的體外降解行為（4周周期）、Sr2?釋放曲線及QK肽釋放動(dòng)力學(xué)（圖2B、C）。如圖2B降解曲線所示，通過AC-PEG-NHS偶聯(lián)QK肽的水凝膠較未修飾組降解更緩慢，28天后仍保留約91%初始質(zhì)量；而直接摻雜Sr-LDH@PDA納米片的水凝膠降解最快，這可能是由于無機(jī)納米材料的引入破壞了水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)所致。對于復(fù)合水凝膠GLQ，盡管含有Sr-LDH@PDA納米片，但因存在AC-PEG-NHS連接的QK肽，28天后仍保留約76%初始質(zhì)量，表明GLQ能維持長期穩(wěn)定性，有利于骨組織再生的持續(xù)緩慢進(jìn)程。

圖2C(a)顯示GLQ復(fù)合水凝膠可實(shí)現(xiàn)Sr2?的持續(xù)緩釋。累積釋放曲線表明，GLQ組的Sr2?釋放顯著慢于GL組，這歸因于QK肽通過AC-PEG-NHS交聯(lián)至GelMA網(wǎng)絡(luò)，強(qiáng)化了水凝膠結(jié)構(gòu)從而延緩降解。值得注意的是，GL與GLQ組在第10天時(shí)均呈現(xiàn)近平臺期釋放特征（累計(jì)釋放約20%），這種與降解進(jìn)程同步的釋放模式能滿足骨質(zhì)疏松條件下骨修復(fù)的長期治療需求。圖2C(b)中QK肽釋放曲線顯示，相較于直接混合QK肽的G/Q組，通過AC-PEG-NHS偶聯(lián)的GLQ組釋放更緩慢。雖然Sr-LDH@PDA納米片的加入部分破壞了水凝膠網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)致QK釋放相對加速，但仍慢于G/Q組。這種納米片介導(dǎo)的加速釋放可能源于雙重機(jī)制：化學(xué)作用（納米顆粒與GelMA基質(zhì)的靜電/氫鍵/共價(jià)交聯(lián)破壞網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性）與物理作用（納米顆粒提升孔隙率并重組微觀結(jié)構(gòu)，促進(jìn)水分滲透和降解動(dòng)力學(xué)）協(xié)同導(dǎo)致水凝膠解體。此外，GQ與GLQ組在第10天趨于平臺期，而G/Q組仍呈加速釋放趨勢，進(jìn)一步證實(shí)AC-PEG-NHS作為連接分子對QK肽緩釋的關(guān)鍵作用。該雙功能PEG交聯(lián)劑中，丙烯酸酯參與光固化GelMA水凝膠形成，NHS則與QK肽的氨基形成穩(wěn)定酰胺鍵，將QK肽錨定于強(qiáng)化網(wǎng)絡(luò)中延長釋放周期。綜上，Sr2?與QK肽的雙重緩釋可延長體內(nèi)有效濃度時(shí)間，減少代謝損耗，提高生物利用度并降低副作用。

圖2 GelMA水凝膠的理化性能、力學(xué)性能及生物相容性

【復(fù)合水凝膠GelMA-QK/Sr-LDH@PDA在體外實(shí)驗(yàn)中顯示出抑制骨吸收、增加前破骨細(xì)胞(pOC)數(shù)量并促進(jìn)PDGF-BB釋放的作用】

經(jīng)過五天破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后，骨髓單核巨噬細(xì)胞(BMMs)的TRAP染色及定量分析結(jié)果如圖3(A、E、F)所示。TRAP染色顯示，常規(guī)誘導(dǎo)的C組和G組BMMs成功分化融合形成多核成熟破骨細(xì)胞(OCs)，細(xì)胞面積大且邊界清晰；而GL組與GLQ組的破骨細(xì)胞融合進(jìn)程顯著受抑，表現(xiàn)為大體積TRAP陽性細(xì)胞數(shù)量較C組明顯減少，且未出現(xiàn)融合的大型成熟OCs(圖3A)。TRAP陽性區(qū)域定量分析(圖3E)證實(shí)GL組與GLQ組數(shù)值顯著低于C組。值得注意的是，對TRAP染色圖像中單核pOC的計(jì)數(shù)結(jié)果顯示(圖3F)，GL組與GLQ組的pOC數(shù)量不僅未被抑制，反而顯著高于G組與C組，這表明Sr-LDH具有增加pOC數(shù)量的作用，與本研究團(tuán)隊(duì)前期圖2E中發(fā)現(xiàn)的含鍶組GL/GLQ促進(jìn)BMM增殖的結(jié)果一致。

本文通過骨吸收實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評估破骨細(xì)胞的骨吸收能力：將BMMs接種于牛骨切片與膠原板上進(jìn)行7天破骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果顯示(圖3B)，常規(guī)誘導(dǎo)的C組與G組骨切片表面出現(xiàn)多個(gè)甲苯胺藍(lán)陽性區(qū)域，并伴有明顯穿孔結(jié)構(gòu)，這些光學(xué)顯微鏡下的半透明區(qū)域是骨吸收的直接證據(jù)；而GL組與GLQ組不僅陽性區(qū)域顯著減少，且未見穿孔痕跡，表明其破骨細(xì)胞骨吸收能力受到顯著抑制。此外，膠原板骨吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果更直觀顯示GL組與GLQ組的骨吸收能力被顯著遏制(圖3C)，相應(yīng)吸收區(qū)域的定量分析結(jié)果(圖3G)與上述發(fā)現(xiàn)趨勢一致。

圖3 GelMA-QK/Sr-LDH@PDA水凝膠在體外抑制破骨細(xì)胞生成并促進(jìn)PDGF-BB釋放

【GelMA-QK/Sr-LDH@PDA水凝膠在體外顯著促進(jìn)成骨作用】

對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行7天成骨誘導(dǎo)后，ALP染色及定量分析結(jié)果如圖4A、D所示。ALP染色圖像顯示，相較于C組與G組，GL組與GLQ組呈現(xiàn)更廣泛的ALP陽性區(qū)域且染色更深。ALP陽性區(qū)域的定量分析結(jié)果與此一致，證實(shí)GL組與GLQ組能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞(OBs)中ALP的表達(dá)。經(jīng)28天成骨誘導(dǎo)后，BMSCs的茜素紅S染色及定量分析結(jié)果如圖4B、E所示。代表性染色圖像顯示，與C組和G組相比，GL組與GLQ組具有更多茜素紅S陽性區(qū)域且礦化結(jié)節(jié)染色更深，定量數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證了這兩個(gè)組別顯著增強(qiáng)了OBs中鈣化結(jié)節(jié)的形成。

為深入探究不同組別水凝膠上清液對BMSCs成骨分化的影響，在7天成骨誘導(dǎo)后提取細(xì)胞RNA并進(jìn)行qRT-PCR分析(圖4G-K)。結(jié)果表明復(fù)合水凝膠GelMA-QK/Sr-LDH@PDA能顯著提升成骨相關(guān)標(biāo)志基因(ALP、Runx2、Osterix、Col1、OPN)的表達(dá)水平。其中Osterix作為成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，GL組較G組表達(dá)量顯著升高，證實(shí)Sr-LDH具有促進(jìn)成骨作用；Runx2則是調(diào)控成骨細(xì)胞分化發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)骨形成、礦化及骨健康維持中不可或缺的OPN與Col1基因的轉(zhuǎn)錄翻譯。

圖4 GelMA-QK/Sr-LDH@PDA水凝膠在體外促進(jìn)成骨分化

【GelMA-QK/Sr-LDH@PDA水凝膠顯著增強(qiáng)體外血管化能力】

通過管形成實(shí)驗(yàn)評估bEnd.3細(xì)胞在不同GelMA水凝膠（G組、GL組和GLQ組）上的血管形成能力，以Matrigel組作為陽性對照（圖5A）。結(jié)果顯示，在GelMA系列水凝膠中，GLQ組最能有效促進(jìn)bEnd.3細(xì)胞形成管狀結(jié)構(gòu)，其環(huán)形結(jié)構(gòu)數(shù)量、分支點(diǎn)數(shù)量及管腔直徑均接近Matrigel組水平（圖5C-E）。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明（圖5B、F），所有GelMA水凝膠組（G、GL、GLQ）均顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移，其中GLQ組增強(qiáng)效果最為突出。G、GL、GLQ三組遷移率依次遞增，證實(shí)Sr-LDH與QK肽均有利于內(nèi)皮細(xì)胞遷移。經(jīng)7天誘導(dǎo)培養(yǎng)后，qRT-PCR檢測顯示（圖5G、H），GLQ組的CD31和vWF基因相對表達(dá)量顯著高于其他組。vWF蛋白水平反映內(nèi)皮細(xì)胞活化狀態(tài)，而CD31（即血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1）對外周血管連接/完整性調(diào)控具有重要作用。該結(jié)果證實(shí)GelMA-QK/Sr-LDH@PDA復(fù)合水凝膠較其他組更能促進(jìn)血管化，此效應(yīng)主要?dú)w功于QK肽的作用，與既往研究結(jié)論一致。G組與GL組的CD31、Emcn相對表達(dá)量無顯著差異，且均顯著低于GLQ組，表明復(fù)合水凝膠中的Sr-LDH對血管化無顯著促進(jìn)作用，進(jìn)一步印證了VEGF模擬肽QK在增強(qiáng)血管化方面的卓越效能。

圖5 GelMA-QK/Sr-LDH@PDA水凝膠在體外增強(qiáng)血管

【GelMA-QK/Sr-LDH@PDA水凝膠顯著促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨缺損模型的體內(nèi)骨再生】

通過Micro-CT掃描與三維重建進(jìn)行骨再生可視化及定量分析（圖6A），術(shù)后8周取材顯示：與假手術(shù)組（Sham）相比，卵巢切除組（OVX）的骨密度（BMD）和骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）顯著降低（圖6C、D）。Goldner三色染色結(jié)果（圖6B）證實(shí)OVX組骨小梁明顯稀疏，結(jié)合Micro-CT結(jié)果成功建立雌激素缺乏型骨質(zhì)疏松大鼠模型，為后續(xù)水凝膠治療效果評估提供臨床前研究平臺。骨缺損造模并植入材料8周后，Micro-CT分析顯示（圖6E-G）：與空白對照組（C組）相比，GLQ組的BMD和BV/TV值顯著提升，表明該復(fù)合水凝膠具有最優(yōu)的骨修復(fù)效能。

圖6 GelMA-QK/Sr-LDH@PDA水凝膠促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨缺損的再生修復(fù)

Goldner染色結(jié)果（圖7A）進(jìn)一步證實(shí)，GLQ組缺損區(qū)實(shí)現(xiàn)完全閉合且與原始皮質(zhì)骨無縫整合（紅色虛線框標(biāo)示），同時(shí)各組均可見水凝膠殘留，說明GelMA水凝膠的緩釋降解特性與骨再生進(jìn)程良好匹配。破骨細(xì)胞TRAP免疫組化染色顯示（圖7B），GLQ組骨再生區(qū)周圍存在多核破骨細(xì)胞聚集的TRAP陽性區(qū)域（圖7C）。結(jié)合同區(qū)域Goldner染色結(jié)果，這些TRAP陽性區(qū)域恰好分布于未礦化的新生骨周圍，提示在骨再生早期階段破骨細(xì)胞尚未啟動(dòng)骨吸收功能。值得注意的是，術(shù)后8周組織學(xué)觀察顯示新生骨仍處于早期礦化階段，遠(yuǎn)未進(jìn)入破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨改建期——該階段通常發(fā)生于修復(fù)期后期，涉及骨痂重塑與骨小梁結(jié)構(gòu)優(yōu)化。CD31免疫組化評估顯示（圖7D），GLQ組缺損區(qū)CD31陽性細(xì)胞數(shù)量最多，骨再生區(qū)域可見多個(gè)由CD31陽性細(xì)胞構(gòu)成的完整血管環(huán)狀結(jié)構(gòu)，環(huán)內(nèi)存在類血小板細(xì)胞，證實(shí)該組血管化程度顯著優(yōu)于其他各組。

圖7 GelMA-QK/Sr-LDH@PDA在骨缺損區(qū)域增加TRAP+與CD31+細(xì)胞，并伴隨更好的骨再生效果

GelMA-QK/Sr-LDH@PDA通過抑制破骨細(xì)胞成熟并保留前體破骨細(xì)胞（pOCs），促進(jìn)PDGF-BB的釋放，從而增強(qiáng)H型內(nèi)皮血管化。圖8A與C-D顯示的TRAP與PDGF-BB免疫熒光及分析表明，GLQ組使骨再生區(qū)TRAP+/PDGF-BB+細(xì)胞數(shù)量增加。結(jié)合圖7C-D組織學(xué)結(jié)果可見，骨再生區(qū)PDGF-BB高表達(dá)，根據(jù)Goldner三色染色與CD31染色結(jié)果，這些TRAP陽性區(qū)域附近還可見增強(qiáng)的新骨形成與血管化。值得注意的是，不同于骨再生良好區(qū)域破骨細(xì)胞數(shù)量通常減少的共識，本研究發(fā)現(xiàn)骨再生區(qū)TRAP表達(dá)升高伴隨更多破骨細(xì)胞，這促進(jìn)了PDGF-BB表達(dá)進(jìn)而加速骨再生。該結(jié)果與圖2E、圖3(F,H,I)的細(xì)胞分子實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致：含Sr2+的GL與GLQ在破骨細(xì)胞生成早期促進(jìn)其增殖，并通過維持pOCs同時(shí)抑制成熟破骨細(xì)胞（OC）來增強(qiáng)PDGF-BB表達(dá)（ELISA與qRT-PCR結(jié)果證實(shí)）。

學(xué)界公認(rèn)血管化在骨再生中起關(guān)鍵作用，其中H型血管作為特殊亞型對骨形成具有顯著調(diào)控作用，與骨量維持及穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。圖8B、E-F的CD31/Emcn共染免疫熒光顯示，相較于對照組，所有GelMA水凝膠組的骨再生區(qū)熒光強(qiáng)度顯著增加，其中GLQ組平均熒光強(qiáng)度最高，表明復(fù)合水凝膠GLQ能促進(jìn)H型血管形成。綜合共染結(jié)果與前期組織學(xué)評估可知，GLQ通過上述機(jī)制增加PDGF-BB釋放，展現(xiàn)出促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨再生的潛力。此外，圖8A中GLQ組合并圖像顯示再生區(qū)內(nèi)殘留水凝膠邊緣與新生骨組織相互嵌合，水凝膠表面可見細(xì)胞浸潤跡象，其降解速率與骨再生進(jìn)程動(dòng)態(tài)匹配，表明該材料是具有臨床轉(zhuǎn)化潛力的骨修復(fù)生物材料。

圖8 GelMA-QK/Sr-LDH@PDA促進(jìn)PDGF-BB釋放并增強(qiáng)H型內(nèi)皮血管化

【總結(jié)與展望】

骨質(zhì)疏松癥一直是全球性重大健康問題。盡管臨床上廣泛使用各類破骨細(xì)胞抑制劑和促骨形成藥物以重建失衡的骨代謝平衡，但這些治療手段在修復(fù)骨質(zhì)疏松性骨缺損時(shí)仍難以實(shí)現(xiàn)充分的血管化和理想的骨再生效果。本研究設(shè)計(jì)了一種多功能復(fù)合水凝膠GelMA-QK/Sr-LDH@PDA，以甲基丙烯?；髂z（GelMA）為載體，整合了鍶負(fù)載納米顆粒（Sr-LDH）。該復(fù)合生物材料系統(tǒng)統(tǒng)籌考慮了Sr-LDH的雙重調(diào)控作用，結(jié)合QK肽的干細(xì)胞招募功能與VEGF擬態(tài)活性，在促進(jìn)成骨與血管化的同時(shí)，還能對破骨細(xì)胞生成過程進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控——通過抑制破骨細(xì)胞成熟并促進(jìn)保留的前體破骨細(xì)胞（pOCs）釋放PDGF-BB，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)H型血管形成，最終在骨質(zhì)疏松條件下實(shí)現(xiàn)骨再生增強(qiáng)。這一策略為未來骨質(zhì)疏松性骨缺損的治療提供了重要臨床轉(zhuǎn)化思路。此外，本研究采用的材料設(shè)計(jì)策略（如通過層狀雙氫氧化物可調(diào)控的化學(xué)組成負(fù)載生物活性離子以靶向調(diào)節(jié)生理/病理過程，或?qū)⒐δ苄远嚯呐c水凝膠系統(tǒng)整合以啟動(dòng)并維持特定生物響應(yīng)）也為其他疾病領(lǐng)域的生物醫(yī)用材料開發(fā)提供了有價(jià)值的參考范式。

參考資料：

https://doi.org/10.1016/j.mtbio.2025.101909

來源：EngineeringForLife