簡(jiǎn)介

默克開發(fā)了兩種新方法，將超濾法作為獲得高滴度病毒的快速且具有成本效益的方法。超濾可用于濃縮來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)上清液、色譜分離組分、環(huán)境來(lái)源等的病毒。

選擇合適的設(shè)備、膜材料、截留分子量（MWCO）、離心速度和時(shí)間對(duì)于實(shí)現(xiàn)感染性病毒顆粒的高回收率至關(guān)重要。Amicon? Ultra和Centricon? Plus-70離心超濾管采用Ultracel? 再生纖維素膜，已成功濃縮噬菌體、腺病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒等。今天這篇內(nèi)容為大家介紹一下如何使用Amicon? Ultra超濾管進(jìn)行噬菌體濃縮。

噬菌體濃縮

簡(jiǎn)介
噬菌體在近一個(gè)世紀(jì)前首次被發(fā)現(xiàn)。從那時(shí)起，噬菌體生物學(xué)引起了研究人員的注意，因?yàn)樗鼈兙哂锌捎糜谥委熑祟惛腥镜挠行⒕芰?。噬菌體和動(dòng)物病毒已成功用作DNA載體或克隆載體?；趌ambda 噬菌體的載體的優(yōu)勢(shì)在于它們可以攜帶高達(dá)25,000 bp的DNA片段。噬菌體展示則是從cDNA文庫(kù)中克隆蛋白質(zhì)的新型遺傳選擇系統(tǒng)。此外，噬菌體和動(dòng)物細(xì)胞病毒之間還有許多相似之處。因此，噬菌體可以被視為動(dòng)物細(xì)胞病毒的模型系統(tǒng)。標(biāo)準(zhǔn)的噬菌體繁殖方法通常涉及宿主細(xì)菌的感染，細(xì)菌生長(zhǎng)12-16小時(shí)后從上清液中回收噬菌體。噬菌體的純化通常包括密度梯度離心、長(zhǎng)時(shí)間透析，然后通過(guò)空斑試驗(yàn)測(cè)定噬菌體滴度。

在某些實(shí)驗(yàn)中，需要高滴度的噬菌體原液。傳統(tǒng)方法是將噬菌體顆粒通過(guò)聚乙二醇（PEG）和葡聚糖硫酸鹽沉淀、酸沉淀或差分或平衡離心濃縮。最近，人們?cè)赟ambrook方法基礎(chǔ)上做了不同改進(jìn)，通過(guò)氯化鈉和PEG沉淀濃縮噬菌體，并重懸至所需滴度。該過(guò)程需要用PEG孵育6-12小時(shí)，并進(jìn)行漫長(zhǎng)的顆粒重懸過(guò)程，以實(shí)現(xiàn)高顆?；厥章?。超濾是實(shí)現(xiàn)高噬菌體滴度的替代方法。當(dāng)不需要從細(xì)胞和培養(yǎng)基蛋白中完全純化時(shí)，可以使用離心超濾快速濃縮噬菌體。超濾也可用于濃縮環(huán)境來(lái)源的噬菌體。對(duì)于大體積裂解物，Amicon? 攪拌式超濾杯是更好的選擇。
正確的膜材料、孔徑、離心速度或壓力以及最終截留體積對(duì)于獲得高噬菌體回收率和保持其感染性是關(guān)鍵要素。如下操作方法描述了使用Millipore? 超濾裝置來(lái)濃縮Pseudomonas pseudo-alcaligenes（假單胞菌假堿性噬菌體phi-6），一種包膜dsRNA病毒。病毒粒子是球形的，直徑為86nm。

方法

phi-6的制備
注意：所有操作都應(yīng)在超凈工作臺(tái)中使用無(wú)菌技術(shù)進(jìn)行。
1、培養(yǎng)假堿假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物，直到600nm吸光度達(dá)到0.1。
2、用足夠的phi-6接種培養(yǎng)物，感染復(fù)數(shù)（MOI）達(dá)到0.5。
3、將含有假單胞菌假堿性培養(yǎng)物的phi-6放回?fù)u床中，在26°C 125RPM下孵育18-24小時(shí)。
4、孵育過(guò)夜后，將培養(yǎng)物分裝到四個(gè)250 mL離心瓶中。將瓶子以16,000 x g離心30分鐘。
5、取出上清液并轉(zhuǎn)移到無(wú)菌容器中。

使用具有50 kDa NMWL膜的Amicon? Ultra-4或Ultra-15超濾管進(jìn)行濃縮。

1、使用Millipore? 帶有低吸附0.22μm PES膜的無(wú)菌過(guò)濾裝置，Stericup? 無(wú)菌過(guò)濾杯(目錄號(hào)S2GPU05RE），Steri-flip? 過(guò)濾器（目錄號(hào)SCGP00525），或Millex-GP? 針頭式過(guò)濾器（目錄號(hào)SLGPR33RB）對(duì)phi-6上清液進(jìn)行過(guò)濾澄清

2、將適量經(jīng)澄清的phi-6上清液（4或15mL）加載到帶有50,000NMWL再生纖維素膜的Amicon? Ultra-4 超濾管（目錄號(hào)UFC805096）或Amicon? Ultra-15超濾管（目錄號(hào)UFC905096）上。

3、將超濾管（4或15 mL）以1,500 × g離心15分鐘。

4、Amicon Ultra?-4超濾管樣品回收體積為80–100μL，Amicon? Ultra-15 超濾管回收體積為350–500μL。

注意：避免將樣品濃縮到推薦體積以下，以免導(dǎo)致噬菌體回收率降低。

結(jié)果
采用Ultracel? 再生纖維素膜的Millipore? 超濾裝置具有低非特
異性結(jié)合和高截留物回收率的顯著優(yōu)點(diǎn)。豎膜設(shè)計(jì)可減少濃度極化，實(shí)現(xiàn)超快的濃縮，特別適用于渾濁和粘稠溶液。

如實(shí)驗(yàn)方案所示，通過(guò)離心超濾，噬菌體滴度可在15 分鐘內(nèi)增加多達(dá)30倍，樣品體積可達(dá)15 mL。 50 kDa 的Amicon? Ultra-4和Ultra-15超濾管可以成功地用于將噬菌體phi-6從細(xì)菌培養(yǎng)上清液中濃縮出來(lái)。不建議使用100 kDa的超濾管，病毒會(huì)漏到濾液中而降低回收率。

實(shí)驗(yàn)使用的默克超濾產(chǎn)品表