抗體偶聯(lián)藥物（ADC）是近年來備受矚目的藥物類型，截至到2025年8月，全球共有19款A(yù)DC 藥物上市。ADC藥物融合了抗體的靶向性與小分子細(xì)胞毒性藥物的殺傷力，但這種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)也為化學(xué)、制造及質(zhì)量控制帶來了不小的挑戰(zhàn)。在ADC藥物的工藝開發(fā)過程中，重點(diǎn)關(guān)注的關(guān)鍵的質(zhì)量屬性包括藥物與抗體的偶聯(lián)率（DAR值）、不同藥物偶聯(lián)組分分布、分子大小變異體（聚集體和片段等）、游離藥物殘留和有機(jī)溶劑殘留等，這些都需要通過精細(xì)的純化策略來嚴(yán)格控制和去除。本文旨在全面解析ADC藥物的純化方法及其發(fā)展前景。

ADC的典型生產(chǎn)流程

起始的單抗中間體通常保存在適宜其穩(wěn)定性的緩沖液中。若需要可經(jīng)過切向流過濾（TFF）去除其中的小分子保護(hù)劑（例如糖類、氨基酸類等），同時(shí)將抗體置換到適合偶聯(lián)反應(yīng)的緩沖液體系。隨后對(duì)單抗中間體進(jìn)行修飾（例如還原、氧化、酶促反應(yīng)等），在抗體中間體引入可以與小分子細(xì)胞毒性藥物偶聯(lián)的活性基團(tuán)。最后通過引入的活性基團(tuán)與小分子細(xì)胞毒性藥物偶聯(lián)，從而得到ADC中間體。然而，ADC中間體中除了預(yù)期的ADC分子外，還可能存在游離的小分子藥物、有機(jī)溶劑、偶聯(lián)相關(guān)雜質(zhì)（還原劑、抗氧化劑、催化酶等）、DAR值（藥物與抗體的偶聯(lián)率）不符預(yù)期的ADC分子（未偶聯(lián)抗體、非特異性偶聯(lián)組分等）以及聚體等雜質(zhì)，因此需要進(jìn)一步的純化處理。簡(jiǎn)單的TFF方法雖可用于去除小分子雜質(zhì)（還原劑、抗氧化劑、游離藥物等），但對(duì)于非預(yù)期DAR的ADC分子、催化酶和聚體等雜質(zhì)，則需采用層析技術(shù)進(jìn)行分離。最終，純化后的ADC分子會(huì)通過TFF換液至其最終保存的緩沖液體系中。

由于ADC復(fù)雜的結(jié)構(gòu)使得其下游純化難度也大大增加。ADC藥物純化方式主要有：1、切向流過濾（TFF）；2、尺寸排阻色譜（SEC）；3、疏水色譜（HIC）；4、羥基磷灰石層析（HA）；5、活性炭深層過濾以及膜層析（MC）等。

切向流過濾（TFF）在ADC生產(chǎn)工藝中發(fā)揮著重要作用

切向流過濾中的超濾滲濾（UF/DF）工藝，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于ADC類藥物的純化工藝中，其主要用于目的是去除有機(jī)雜質(zhì)、偶聯(lián)相關(guān)雜質(zhì)以及緩沖液的置換。此外，UF/DF作為ADC純化過程中一種工藝其收率也可保持在90%以上，相關(guān)研究表明小分子雜質(zhì)（有機(jī)雜質(zhì)、偶聯(lián)相關(guān)雜質(zhì)）分子量要低于膜孔徑，因此過濾過程中pH、膜載量、跨膜壓差以及流速對(duì)于小分子雜質(zhì)去除影響較小，工藝具有較強(qiáng)的穩(wěn)健性。

然而，TFF也面臨一些挑戰(zhàn)。首先，某些高度疏水性的藥物-連接子化合物可能誘發(fā)自聚集，形成大分子膠束，當(dāng)這些膠束尺寸超過膜包截留分子量時(shí)，便難以通過TFF去除。針對(duì)這一問題，可以嘗試使用層析方法或降低藥物-連接子化合物的疏水性來解決。例如，通過篩選不同的巰醇衍生物來淬滅有效負(fù)載的馬來酰亞胺基團(tuán)，發(fā)現(xiàn)L-半胱氨酸淬滅后能有效去除有效負(fù)載衍生物，而其他淬滅劑效果則較差。

此外，TFF無法去除聚體雜質(zhì)，因?yàn)榫垠w的分子量通常等于或大于ADC單體，會(huì)被膜包截留。同時(shí)，TFF也無法分離偶聯(lián)后具有不同DAR值的ADC混合物。對(duì)于這些單抗相關(guān)雜質(zhì)的去除，需要借助層析技術(shù)等方法。

尺寸排阻色譜（SEC）

尺寸排阻色譜是一種基于分子量差異而進(jìn)行分離純化的一種層析方式。SEC在ADC純化過程中可以起到緩沖液置換（脫鹽）、去除非蛋白雜質(zhì)（小分子雜質(zhì)，如小分子細(xì)胞毒性藥物、有機(jī)溶劑等）以及去除聚集體等作用。此外SEC通常在較為溫和的條件下進(jìn)行層析（中性pH緩沖液以及室溫條件），有利于ADC類藥物維持穩(wěn)定。然而事實(shí)有多篇研究報(bào)道ADC分子與SEC填料存在相互作用，（即ADC分子與SEC填料沒有別的相互作用力如疏水力以及離子作用力），因此在SEC工藝開發(fā)填料篩選階段我們需要盡可能選擇相互作用小的填料來進(jìn)行工藝開發(fā)。

疏水作用色譜（HIC）

疏水相互作用層析（HIC）的機(jī)理如下：生物分子表面的疏水基團(tuán)在高鹽濃度下逐漸暴露，通過疏水相互作用與介質(zhì)的疏水配基結(jié)合；鹽濃度下降，分子表面水化程度增加，導(dǎo)致疏水相互作用減弱，從而實(shí)現(xiàn)不同疏水性組分的洗脫。ADC類藥物的純化除了應(yīng)該關(guān)注小分子類雜質(zhì)、聚集體外還應(yīng)該注重非預(yù)期DAR類雜質(zhì)的去除。由于SEC層析對(duì)非預(yù)期DAR組分的分辨率較低，因此非預(yù)期DAR組分的雜質(zhì)通常需要通過疏水作用色譜來進(jìn)行去除。由于ADC藥物偶聯(lián)了疏水性較強(qiáng)的連接子藥物（Linker-payload）,因此單克隆抗體與不同DAR值的組分具有疏水性差異，因此可以通過疏水層析進(jìn)行去除非預(yù)期DAR組分。如基于鏈間半胱氨酸偶聯(lián)的ADC，通常會(huì)產(chǎn)生五種不同的產(chǎn)物（即DAR=0,2,4,6,8），可以通過疏水作用色譜結(jié)合線性梯度洗脫進(jìn)行分離。

在HIC層析過程中，需要確保不同洗脫峰之間的高分辨率和ADC的高收率是關(guān)鍵，這需要針對(duì)填料和流動(dòng)相條件進(jìn)行精細(xì)優(yōu)化。通常來說可以在層析緩沖液中添加硫酸銨來輔助疏水層析過程中對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的捕獲，然而在ADC類藥物純化的過程中，硫酸銨的添加可能會(huì)導(dǎo)致ADC產(chǎn)生沉淀，HIC層析步驟收率偏低，因此針對(duì)這種情況可選用疏水性較弱的NaCl來克服上述問題。

疏水層析除了對(duì)不同DAR組分具有較好的分離效果，還也可以對(duì)游離藥物、有機(jī)溶劑以及聚集體等雜質(zhì)具有較好的去除能力。但是HIC層析仍然有峰分辨率低、收率偏低的問題，需要在工藝開發(fā)階段著重優(yōu)化。

離子交換色譜IEC

離子交換色譜(IEC)通過目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)電荷差異來進(jìn)行分離純化，通常離子交換色譜具有較高的回收率并去除非抗體相關(guān)化合物可以應(yīng)用于游離小分子類雜質(zhì)、宿主DNA、宿主蛋白、內(nèi)毒素、電荷變異體以及聚集體等雜質(zhì)的去除，因此離子交換是ADC藥物精純階段具有潛力的候選工藝。。因此，IEC 是一種很有前途的純化 ADC 的方法。

以陽離子層析為例，調(diào)整上樣樣品環(huán)境，ADC與層析柱上帶有負(fù)電荷的配基結(jié)合，而游離的藥物和有機(jī)溶劑等則會(huì)流過柱子，不發(fā)生結(jié)合，根據(jù)此原理，可以顯著降低小分子雜質(zhì)的含量，如下圖案例所示，經(jīng)過陽離子層析后，游離藥物含量從上樣樣品的52.2%降至了5%。另外也曾有文獻(xiàn)報(bào)道采用陽離子層析流穿模式可以有效去除ADC藥物中高分子量雜質(zhì)（vHMWS）。

羥基磷灰石層析

羥基磷灰石（HA）色譜是單克隆抗體純化的一種有用方法。HA是鈣和磷的礦物質(zhì)，這種合成形式通過鈣金屬親和及磷酸根陽離子交換與抗體結(jié)合。這一獨(dú)特的特性確保了在去除抗體溶液中的DNA和內(nèi)毒素時(shí)，抗體聚集顯著減少。有研究表明采用羥基磷灰石層析可以使抗體中聚集體的含量由純化前的60%下降到0.1%。目前，只有少數(shù)報(bào)告描述了將羥基磷灰石（HA）色譜應(yīng)用于ADCs的純化，但是羥基磷灰石層析在ADC藥物去除聚集體的方面具有良好的潛力。

混合模式層析

混合模式層析是指同時(shí)具有兩種以上作用模式的層析方法，通常來說用于蛋白類生物制品的混合模式層析主要有兩種，陽離子+疏水模式以及陰離子+疏水模式。相比于傳統(tǒng)的疏水層析以及離子交換層析來說混合模式層析具有較好的操作空間，以及較高的分辨率。

膜層析（MC）

相比于傳統(tǒng)的柱層析的諸多缺陷（收率較低、IEC,HIC層析時(shí)通常需要一定濃度的鹽來進(jìn)行洗脫，鹽的存在不利于樣品的穩(wěn)定儲(chǔ)存），膜層析則收率較高、并且通常流速也較高，可縮短工藝時(shí)間節(jié)省成本。因此，有研究人員將目光轉(zhuǎn)向膜層析，希望以此來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的柱層析。

最近，Zhou 和 Abzena 的同事報(bào)告了 MC 純化ADC 的獨(dú)特應(yīng)用。他們使用 Sartobind 膜（來自Satrorius Stedium Biotech GmbH）的純化方法能夠去除 ADC中的聚集體和殘留藥物連接子以及不同 DAR的分離。有趣的是，他們還成功純化了毒素為吡咯并苯二氮卓二聚體 (PBD) 的 ADC。PBD 具有很強(qiáng)的毒性且具有較強(qiáng)的疏水性。這種高活性的毒素是一把雙刃劍，高活性毒素對(duì)腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷力，但是在ADC 藥物中的少量殘留 PBD 可能會(huì)導(dǎo)致劑量限制性毒性。

除此之外Zhou 的團(tuán)隊(duì)成功地使用兩種不同的膜（Sartobind S 和 Sartobind Phenyl）進(jìn)行串聯(lián)純化。MC 系統(tǒng)的一大優(yōu)點(diǎn)是分離模式可以在高流速和低壓下進(jìn)行。因此，串聯(lián)系統(tǒng)可以通過簡(jiǎn)單地連接兩種不同的膜來實(shí)現(xiàn)，而無需優(yōu)化緩沖液/流動(dòng)條件。這種精細(xì)的純化方法成功地去除了游離的藥物連接體和聚集體，同時(shí)通過單個(gè)單元層析操作精煉了 DAR組分。相信隨著技術(shù)的進(jìn)步，這種無需層析柱的膜層析將會(huì)在ADC類藥物純化工藝中大放光彩。

活性炭深層過濾

活性炭(Activated carbon,AC)是一種經(jīng)一系列加工處理所得到的含碳材料，外觀呈黑色或亮黑色，內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)發(fā)達(dá)，具有比表面積大、吸附能力強(qiáng)等特性，是一種性能優(yōu)良的吸附劑。按來源可分為:木質(zhì)活性炭、果殼活性炭、再生活性炭等;按外觀形態(tài)可分為:粉狀、顆粒狀、球形等?；钚蕴孔陨淼幕瘜W(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,機(jī)械強(qiáng)度高,耐酸堿、耐高溫，對(duì)產(chǎn)品無不良影響，所以被廣泛應(yīng)用于空氣凈化，水處理，食品、醫(yī)藥、味精化工等產(chǎn)品的脫色、除雜精制步驟。

在制藥領(lǐng)域，活性炭深層過濾器除了可以應(yīng)用于脫色、除內(nèi)毒素外，也可以在ADC工藝中有效去除游離毒素等相關(guān)雜質(zhì)。據(jù)測(cè)試經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)過一步活性炭深層膜包過濾可以有效降低毒素水平幾十倍到上百倍，且工藝控制參數(shù)范圍廣。從不同項(xiàng)目的反饋結(jié)果來看，活性炭深層也具有廣泛的適應(yīng)性，可以用于多種毒素類雜質(zhì)的有效去除。

其他層析方法

除了上述純化方法外，ADC 分析領(lǐng)域還報(bào)道了一些其他層析技術(shù)。親和層析通常用于評(píng)估抗體的特性。除了蛋白 A 之外，蛋白 G 和蛋白 L 對(duì) Fc 受體表現(xiàn)出親和力，可用于抗體表征。最近，Tosoh Bioscience推出了一種親和層析柱，由固定有重組FcγIIIa受體配體的無孔聚合物顆粒組成。這種有用的分析工具用于在天然條件下對(duì)抗體進(jìn)行聚糖分析。最近，該工具被用來分析 ADC 并評(píng)估 ADC 的異質(zhì)性。這種在天然條件下的進(jìn)行的層析方法的性質(zhì)可能在 ADC 純化中具有巨大的潛力。

親水相互作用色譜 (HILIC) 是評(píng)估抗體糖基化譜的另一種可能方法，在 ADC 分析和制備中也具有潛在應(yīng)用。使用 HILIC 柱對(duì)生物仿制藥抗體進(jìn)行定性比較。HILIC 固定相是分離復(fù)雜混合物中極性化合物的有效方法。由于代謝物具有適當(dāng)?shù)臉O性，這一獨(dú)特的功能應(yīng)該會(huì)促進(jìn)分析化學(xué)家將 HILIC 用于生物分析。盡管 HILIC 具有這種特性，但只有少數(shù)報(bào)告描述了 HILIC 分離在 ADC 分析中的應(yīng)用。

未來展望

從CMC的主要優(yōu)勢(shì)和擴(kuò)大ADCs的治療指數(shù)，探索位點(diǎn)特異性偶聯(lián)技術(shù)以產(chǎn)生均質(zhì)ADCs的趨勢(shì)將會(huì)持續(xù)。

例如，酶催化是實(shí)現(xiàn)ADCs位點(diǎn)特異性偶聯(lián)的方法之一。目前已有多個(gè)酶催化位點(diǎn)特異性偶聯(lián)的ADCs處于不同的臨床研究階段。酶催化偶聯(lián)能夠因?yàn)槊傅奶禺愋宰R(shí)別位點(diǎn)而生產(chǎn)出DAR值組分均一的ADCs。但是酶催化偶聯(lián)方法也在ADC生產(chǎn)中使用的潛在問題，例如從ADC中去除催化酶可能具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)槊傅姆肿哟笮『臀锢硇再|(zhì)可能與ADCs非常接近，從而給它們的分離帶來了挑戰(zhàn)，顯然需要開發(fā)新的純化方法來克服這個(gè)問題。

除了新穎的偶聯(lián)技術(shù)之外，我們還必須考慮不斷發(fā)展的新模態(tài)領(lǐng)域。在不久的將來，模式將多樣化，以促進(jìn)與“常規(guī)”抗體不同的分子形式的生產(chǎn)。雙特異性抗體和 Fc 融合蛋白等復(fù)雜的抗體相關(guān)物已在腫瘤學(xué)界變得流行。此外，可能需要將這些抗體相關(guān)化合物轉(zhuǎn)化為 ADC。為了生產(chǎn)這些新型 ADC 同類產(chǎn)品，可能需要新的尖端純化策略。

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