高效培育高產(chǎn)抗逆作物新品種 是 保障 糧食 安全 的重要策略 ，優(yōu)異等位基因是作物 新品種培育 的核心遺傳基礎(chǔ)，但現(xiàn)有基因資源已難以滿足日益提升的育種需求。定向進化技術(shù)能在短時間內(nèi)為目的基因賦予改進的或全新的生物學(xué)功能，可快速地生成育種所需的優(yōu)異等位基因，因而有望 成為突破 作物育種 遺傳資源 瓶頸 的有效途徑。

目前， 微生物及動物細胞中 已建立多種定向進化系統(tǒng)，但這些系統(tǒng) 通 常 不 適用于植物基因 。 這是由于 植物基因的功能 往往 依賴植物特有的 翻譯后修飾、分子間相互作用及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在非植物體系中 難以 維持天然 活性 。因此， 許多植物特異性基因 和功能 無法 在 異源系統(tǒng) 中有效 表征 。然而，當前尚無直接在植物體內(nèi)實現(xiàn)定向進化的系統(tǒng)。

2025 年 10 月 3 日，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞團隊與中國科學(xué)院微生物研究所邱金龍團隊合作在 Science 在線發(fā)表了題為

Engineered geminivirus replicons enable rapid in planta directed evolution

在植物中搭建定向進化系統(tǒng)，其主要挑戰(zhàn)在于：除分生組織外，植物其他部位的體細胞普遍增殖緩慢，這一特性會顯著制約定向進化過程中所需的突變積累與篩選效率。 為解決這一問題，研究團隊創(chuàng)新性地借助雙生病毒（ Geminivirus ） —— 這類植物單鏈環(huán)狀 DNA 病毒具備通過滾環(huán)復(fù)制在植物細胞中快速擴增的特性 —— 開展研究。團隊提出核心設(shè)想：若將目的基因的預(yù)期生物學(xué)功能與病毒的滾環(huán)復(fù)制機制相偶聯(lián)，便可依托病毒高效的 DNA 擴增能力，快速完成基因變體的篩選與富集，最終實現(xiàn)目的基因在植物體內(nèi)的定向進化。 為了實現(xiàn)這一設(shè)想，研究 團隊 首先 對 雙生 病毒復(fù)制子 進行 工程化改造 ， 實現(xiàn) 滾環(huán)復(fù)制 過程 與基因功能 的 偶聯(lián) 。基于 人工 病毒 復(fù)制子 ， 研究團隊 進一步 開發(fā)了高通量植物體內(nèi)定向進化系統(tǒng) GRAPE ： 體外誘變目的基因，并構(gòu)建成復(fù)制子文庫；根據(jù)目的基因的 生物學(xué)功能 設(shè)計遺傳通路， 使 其與復(fù)制子的滾環(huán)復(fù)制正向或負向偶聯(lián)； 通過農(nóng)桿菌滲入 法 將復(fù)制子文庫 導(dǎo)入 本氏煙葉片 ， 讓文庫在葉片內(nèi)完成復(fù)制和篩選 ； 深度測 序計算每一個目的基因變體在文庫中的占比變化 —— 促進 復(fù)制 的變體會得到富集，而抑制 復(fù)制 的變體則被淘汰。

利用 GRAPE 系統(tǒng) ，研究團隊 成功實現(xiàn)了 多種 植物 免疫受體 的 快速 定向進化 。 植物 NLR 免疫受體是免疫系統(tǒng)的核心組分，其激活會引發(fā)超敏細胞死亡 ，而這一反應(yīng) 難以在微生物或動物細胞中進行表征， 制約 了這類 蛋白 的 功能 優(yōu)化 與新功能 開發(fā) 。 利用 GRAPE 平臺，研究團隊對 茄科中關(guān)鍵的輔助 NLR 蛋白 NRC3 進行了定向進化 ， 借助細胞死亡將 NRC3 的功能與復(fù)制子的滾環(huán)復(fù)制相偶聯(lián)，獲得了一系列 保留免疫活性的同時 可以 不受 線蟲效應(yīng)蛋白 SPRYSEC15 抑制的 NRC3 變體 。 此外，針對 水稻 整合誘餌型 NLR 免疫受體 Pikm-1 ， 研究團隊 利用 GRAPE 進行 兩輪迭代定向進化， 獲得了可以 同時 識別 稻瘟菌 AVR-Pik 效應(yīng)子 6 種 亞型并 激發(fā) 免疫反應(yīng)的 Pikm-1 變體， 系統(tǒng)拓展 了 Pikm-1 的效應(yīng)子識別譜 。 該策略為抗病作物 育種 創(chuàng)造了寶貴的遺傳資源。

研究團隊已證實， 眾多不同基因亦可借助 GRAPE 系統(tǒng)實現(xiàn)功能進化。 雙生病毒復(fù)制子的滾環(huán)復(fù)制可與多個目的基因的生物學(xué)功能形成正向偶聯(lián) ： 如內(nèi)含肽、序列特異性蛋白酶與重組酶，這類基因能通過正選擇 實現(xiàn) 功能進化 ； 同源重組因子、 序列特異性核酸酶等 可與滾環(huán)復(fù)制形成負向偶聯(lián)，進而通過負選擇實現(xiàn)功能的定向進化。這些研究結(jié)果進一步驗證了 GRAPE 系統(tǒng)的通用性，也 展示 了其作為 高度適配植物 體內(nèi)環(huán)境的 蛋白質(zhì)工程平臺的應(yīng)用潛力。

綜上所述，研究團隊基于工程化改造的雙生病毒復(fù)制子，首次在植物體內(nèi)建立了高效定向進化系統(tǒng)。該系統(tǒng)可在單張本氏煙葉片上，于4天內(nèi)完成對多達105個目的基因變體的篩選。由于整個篩選過程均在植物體內(nèi)進行， 其進化產(chǎn)物 無需額外優(yōu)化 即 可直接 應(yīng)用。 GRAPE 系統(tǒng)為加速植物分子育種與合成生物學(xué)研究提供了快速、高效 的技術(shù)平臺，也 為植物基因及蛋白的工程化改造開辟了全新技術(shù)路徑。 正如審稿人所評價的： “ 該研究的 獨特之處在于建立 了植物體內(nèi)定向進化方法，填補了 當前植物生物 學(xué)領(lǐng)域的一項重要空白。 該 技術(shù)進步有望對這一快速發(fā)展的研究領(lǐng)域 產(chǎn)生重大影響 。 ”

植物體內(nèi)定向進化系統(tǒng)（ GRAPE ） 示意圖及其應(yīng)用

中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究員、中國科學(xué)院微生物研究所邱金龍研究員為論文的共同通訊作者。 中國科學(xué)院 遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所博士后祝皓誠、微生物研究所已畢業(yè)博士生覃旭、遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所博士研究生魏樂妍、博士后姜丹丹為該論文的共同第一作者。 中國科學(xué)院 遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所碩士研究生張巧、 博士后王文乾、助理研究員梁榮洪、副研究員張瑞、 副研究員陳坤玲 、 北京齊禾生科生物科技有限公司 首席技術(shù)官 趙天萌 、 高級科學(xué)家 張康、 高級科學(xué)家 劉關(guān)穩(wěn)在課題研究中做出了重要貢獻。中國科學(xué) 院微生物研究所葉健研究員為本研究提供了 重要 實驗材料。

http://doi.org/10.1126/science.ady2167