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01

Introduction

非小細胞肺癌（NSCLC）占肺癌病例的80%以上，是全球癌癥相關(guān)死亡的首位原因。作為一種難治性癌癥，肺癌的治療充滿了挑戰(zhàn)。免疫治療是繼手術(shù)、放療、化療和靶向治療后的又一重大腫瘤治療方式。膳食補充劑常被用于預(yù)防癌癥、減緩癌癥進展或提高免疫力，是一種很有前景的輔助治療策略。

中藥地骨皮（LRC）是枸杞的干燥根皮，具有涼血除蒸、清肺降火的功效，2002年被列入"藥食同源"目錄?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，地骨皮及其組分具有抗病毒、抗菌、降血脂、降壓、降糖等多種藥理活性。目前，關(guān)于地骨皮的抗癌作用研究極少，僅少量研究報道了地骨皮可促進膠質(zhì)瘤細胞凋亡，抑制膠質(zhì)瘤生長。迄今為止，已從地骨皮中分離出130多種成分。芹菜素是地骨皮中的一種膳食黃酮類化合物，具有廣泛的生物活性，能直接抑制肺癌細胞生長或誘導(dǎo)細胞凋亡，還可以抑制血管生成，增強肺癌化療敏感性，促進抗腫瘤免疫反應(yīng)。蒙花苷同樣是地骨皮中的膳食類黃酮，具有顯著的抗炎、抑制肺癌細胞生長和侵襲等藥理活性。這些組分的存在支持地骨皮“藥食同源”的特性。

經(jīng)典名方瀉白散被用于治療肺癌，地骨皮是瀉白散的組成之一。然而，地骨皮對NSCLC的抗腫瘤作用及其機制尚不清楚。廣州中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究中心張韌課題組通過Lewis肺癌小鼠模型，探究地骨皮對肺癌的抑制作用及其機制，闡明了地骨皮能通過增強抗腫瘤免疫抑制非小細胞肺癌生長的作用機制。這項研究為地骨皮作為保健食品增強NSCLC患者抗腫瘤免疫提供了研究基礎(chǔ)。

02

Results and Discussion

地骨皮可有效抑制體內(nèi)腫瘤生長

體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，地骨皮顯著降低了腫瘤體積（圖1A和C）和重量（圖1B），并未伴隨顯著的體重下降（圖1D）。小鼠肝臟和腎臟的H&E染色結(jié)果顯示地骨皮治療沒有毒性（圖1E），表明小鼠對地骨皮治療有較好的耐受性。先前的研究發(fā)現(xiàn)地骨皮不能抑制人NSCLC細胞株A549和H1299的增殖，與先前的研究一致，地骨皮在體外同樣不能抑制小鼠肺癌細胞系LLC的增殖（圖1F）。這些結(jié)果表明，地骨皮對LLC荷瘤小鼠NSCLC進展的抑制不是由于地骨皮的腫瘤選擇性細胞毒性，這提示地骨皮可能通過免疫應(yīng)答發(fā)揮其抗腫瘤作用。

圖1地骨皮抑制小鼠肺癌的生長

地骨皮增強了機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)

為了驗證地骨皮對抗腫瘤免疫反應(yīng)的影響，首先觀察了每組小鼠的免疫器官，發(fā)現(xiàn)地骨皮對脾臟（圖2A）和胸腺（圖2B）的質(zhì)量沒有明顯影響。ELISA結(jié)果表明，與對照組相比，接受高劑量地骨皮治療的小鼠血清中IL-2和IFN-γ（與T淋巴細胞活性相關(guān)）的水平顯著升高（圖2C和D）。為了進一步探索地骨皮對免疫的影響，對地骨皮處理組與對照組小鼠的脾臟進行了一般轉(zhuǎn)錄組測序。兩組測序結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)了5107個差異表達基因（2180個上調(diào)基因和2927個下調(diào)基因；圖2E）。層次聚類分析表明，地骨皮治療的小鼠基因表達譜發(fā)生了顯著改變（圖2F）。從測序數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)地骨皮顯著上調(diào)了CD40lg、TCR、Zap70、Lck和TNF等參與T細胞活化的基因轉(zhuǎn)錄水平（圖2G）。GSEA結(jié)果還顯示地骨皮治療與TCR信號通路和白細胞跨內(nèi)皮遷移通路的上調(diào)顯著相關(guān)（圖2H，I）。這些結(jié)果表明地骨皮在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，并提示地骨皮誘導(dǎo)部分活化的淋巴細胞向腫瘤遷移。

圖2地骨皮增強了機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)

地骨皮促進腫瘤中CD8+ T細胞的浸潤和活性

為了探究地骨皮是否誘導(dǎo)了淋巴細胞向腫瘤組織遷移，對腫瘤進行了一般轉(zhuǎn)錄組測序，并對腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）進行定量。腫瘤組織H&E染色結(jié)果顯示，地骨皮治療組中TILs較對照組顯著增加（圖3A）。同時，TIMER數(shù)據(jù)庫免疫浸潤分析結(jié)果也顯示地骨皮促進了CD8+ T細胞浸潤（圖3B，C）。GSEA分析進一步還發(fā)現(xiàn)，地骨皮促進了IL-12家族信號通路（與免疫效應(yīng)細胞浸潤密切相關(guān)），以及負調(diào)控T細胞凋亡過程（圖3D，E）。這些結(jié)果表明地骨皮能促進腫瘤中的TILs浸潤，并提示地骨皮可以減少T細胞凋亡。為了證實這一點，采用免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)地骨皮促進GZMB+CD8+ T淋巴細胞浸潤到腫瘤組織中（圖3F，G）。總之，這些結(jié)果表明地骨皮促進了腫瘤中CD8+ T細胞的浸潤和活性。

圖3地骨皮促進腫瘤中CD8+ T細胞的浸潤和活性

地骨皮通過PD-L1/PD-1通路影響抗腫瘤免疫反應(yīng)

接著探索了地骨皮對抗腫瘤免疫反應(yīng)的作用機制。從脾臟mRNA測序數(shù)據(jù)GSEA結(jié)果中發(fā)現(xiàn)PD-1（程序性死亡受體1）的下游通路，包括RAS、MAPK、JAK-STAT和PI3K-Akt信號通路，均被地骨皮上調(diào)（圖4A）。PD-1存在于T淋巴細胞膜上，與腫瘤細胞表面的PD-L1（程序性死亡受體配體1）結(jié)合后會導(dǎo)致T細胞自身細胞凋亡，促進腫瘤免疫逃逸。因此，推測地骨皮對抗腫瘤免疫應(yīng)答的影響是通過PD-L1/PD-1通路介導(dǎo)的。構(gòu)建了穩(wěn)定過表達PD-L1的肺癌細胞株（A549-PD-L1-OE，圖4B），并將其與PBMCs共培養(yǎng)，其中T淋巴細胞在體外用CD3/CD28抗體激活。共培養(yǎng)實驗結(jié)果顯示A549-NC和A549-PD-L1-OE細胞的凋亡百分比分別為64%和9%（圖4C，D），PD-L1過表達顯著抑制了活化PBMCs對腫瘤細胞的殺傷作用，而4 μg/mL和12 μg/mL LRC逆轉(zhuǎn)了PD-L1過表達的作用，并提高了活化PBMCs的腫瘤殺傷效果。由于LRC對PBMC增殖的影響幾乎可以忽略不計（圖4E），這些結(jié)果證明LRC對抗腫瘤免疫反應(yīng)的影響是由PD-L1/PD-1通路介導(dǎo)的。

圖4地骨皮通過PD-L1/PD-1通路影響抗腫瘤免疫反應(yīng)

地骨皮通過結(jié)合PD-L1抑制PD-L1/PD-1相互作用

A549-PD-L1-OE細胞中PD-L1的持續(xù)表達是外源性的，因此地骨皮對PD-L1/PD-1通路的影響（圖4C，D）至少部分依賴于干擾PD-L1功能。因此，假設(shè)地骨皮抑制PD-L1/PD-1的結(jié)合。均相時間分辨熒光技術(shù)證實地骨皮能阻斷PD-L1和PD-1的相互作用，IC50為519 μmol/L（圖5A）。接著，使用生物膜干涉技術(shù)測定出地骨皮和PD-L1的KD值為1.9 μmol/L，表明兩者有較好的親和力（圖5B）。上述實驗結(jié)果證明地骨皮通過與PD-L1結(jié)合來阻斷PD-L1和PD-1之間的相互作用。為了進一步證實這點，用PHA刺激Jurkat T細胞，使其產(chǎn)生PD-1（圖5C）。然后用PD-L1蛋白孵育表達PD-1的Jurkat T細胞制備細胞模型，流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)PD-L1增強了Jurkat T細胞的凋亡，而地骨皮有效地抑制了PD-L1介導(dǎo)的Jurkat T細胞凋亡誘導(dǎo)（圖5D）。Western blot檢測凋亡關(guān)鍵標志物Caspase 3，也證實了這一發(fā)現(xiàn)（圖5E）。PD-L1誘導(dǎo)T細胞耗竭的原理是由于PD-L1與PD-1結(jié)合導(dǎo)致PD-1的細胞質(zhì)尾部磷酸化并募集p-SHP2，從而去磷酸化下游多條通路，最終抑制T細胞的活化，隨后定量分析了PD-L1孵育后的Jurkat T細胞中p-SHP2表達水平。結(jié)果顯示PD-L1增加了p-SHP2水平，而地骨皮顯著降低了由PD-L1引起的p-SHP2水平升高（圖5E）。地骨皮對Jurkat T細胞的增殖沒有抑制作用（圖5F）。這些結(jié)果證實了地骨皮與PD-L1相互作用，抑制PD-L1/PD-1的結(jié)合。

圖5地骨皮通過結(jié)合PD-L1抑制PD-L1/PD-1相互作用

03

Conclusion

本研究探討了地骨皮的抗肺癌作用及其機制，證明地骨皮可與PD-L1結(jié)合并阻斷其與PD-1的相互作用，恢復(fù)T淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷活性。這些結(jié)果為地骨皮作為保健食品增強NSCLC患者抗腫瘤免疫提供了研究基礎(chǔ)，也為進一步篩選靶向PD-L1的天然小分子抑制劑提供參考。

第一作者

尹衡，男，廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2021屆碩士研究生，主要研究方向為中醫(yī)藥抗腫瘤免疫。目前主持廣州市基礎(chǔ)研究計劃基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目1項，以第一或共一作者發(fā)表論文3篇。

通信作者

張韌，男，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。畢業(yè)于中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院，曾在加州大學(xué)戴維斯分校、亞拉巴馬州立大學(xué)伯明翰分校學(xué)習(xí)?，F(xiàn)任廣州中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究中心主任。講授《醫(yī)學(xué)免疫學(xué)》、《醫(yī)學(xué)微生物學(xué)》、《細胞生物學(xué)》。從事藥食同源中藥及其活性成分在抗腫瘤免疫中的作用、機制以及新藥開發(fā)研究。承擔國家自然科學(xué)基金、廣東省自然科學(xué)基金、廣州中醫(yī)藥大學(xué)英才計劃、廣東省高校教學(xué)質(zhì)量工程特色專業(yè)等項目。以負責人申請獲批1項廣東省一流本科專業(yè)建設(shè)點。以第一或通訊作者（含共同）在Cellular & Molecular Immunology、Phytomedicine、Phytotherapy Research等國內(nèi)外期刊發(fā)表文章30余篇，其中SCI文章近20篇。獲得中國發(fā)明專利授權(quán)2項。

Lycii Radicis Cortex suppresses the growth of non-small cell lung cancer via enhancing the anti-tumor immunity

Heng Yina,1, Meng Liua,1, Yaling Zhaoa,1, Haitao Wub, Danna Zhengc, Zhenhui Guoa, Ying Zhoua, Shaofeng Wua, Chuanbing Chend, Lei Zhangd, Shanshan Songe,*, Yanli Hef,*, Ren Zhanga,*

a Research Centre of Basic Integrative Medicine, School of Basic Medical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China

b Science and Technology Innovation Center, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China

c The First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510006, China

d School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China

e Integrated Hospital of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510315, China

f Department of Pathology and Pathophysiology, School of Basic Medical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

Lycii Radicis Cortex (LRC) is a medicinal and food homologous plant with various pharmacological activities, including anti-tumor effects. This study explores the anti-tumor effect of LRC on non-small cell lung cancer (NSCLC) and its molecular mechanism using mice bearing Lewis lung carcinoma cells. LRC significantly suppressed the growth of NSCLC. Besides, RNA sequencing of mice tumors and hematoxylin & eosin and immunofluorescence staining revealed that LRC promoted the infiltration of T lymphocytes, specifically GZMB+CD8+T lymphocytes, in tumor tissues. The Gene Set Enrichment Analysis of spleen RNA indicated that LRC up-regulated PD-1-downstream pathways, suggesting that LRC exerted its effects through the PD-L1/PD-1 pathway. Further experiments revealed that LRC interacted with PD-L1, blocking PD-L1/PD-1 binding and thus restoring the T cell killing activity on tumor cells. Together, these results support using LRC as healthy food to improve anti-tumor immunity in patients with NSCLC.

Reference:

YIN H, LIU M, ZHAO Y L, et al.

Lycii Radicis Cortex

本文編譯內(nèi)容由作者提供

編輯：梁安琪；責任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創(chuàng)意