“這項(xiàng)工作側(cè)重在保留連續(xù)空間信息的前提下，利用質(zhì)譜成像實(shí)現(xiàn)較高分辨率和較高覆蓋度的非靶向檢測(cè)?！眻F(tuán)隊(duì)核心成員、共同第一作者王鳳翔博士告訴 DeepTech。

王鳳翔所指的工作正是 iPEX 技術(shù)，其誕生不僅貫穿了她的博士生涯，也切實(shí)瞄準(zhǔn)了空間蛋白質(zhì)組學(xué)的痛點(diǎn)：高分辨率與高靈敏度不可兼得的核心矛盾。

北京時(shí)間 11 月 13 日，Nature 在線發(fā)表了西湖大學(xué)鄒貽龍團(tuán)隊(duì)與 Kiry D. Piatkevich 團(tuán)隊(duì)合作的突破性研究，他們開發(fā)出了“原位膨脹成像蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)（in situ imaging Proteomics via Expansion，iPEX）”。

（來源：Nature）

該技術(shù)基于水凝膠的蛋白質(zhì)錨定、組織膨脹與質(zhì)譜成像分析，能夠讓研究者在不依賴抗體的前提下，以 1-5μm 精度和 10-100 倍靈敏度提升，繪制出蛋白質(zhì)的空間分布圖。它不僅讓蛋白質(zhì)的“地理坐標(biāo)”清晰可見，也在阿爾茨海默癥模型中捕捉到早期線粒體與脂肪酸代謝紊亂的信號(hào)，為揭示復(fù)雜疾病的分子圖譜開辟了新路徑。

（來源：受訪者提供）

讓蛋白顯形：看得清，也測(cè)得準(zhǔn)

長期以來，空間蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)面臨三大核心困境。

其一，免疫熒光、成像質(zhì)譜流式等傳統(tǒng)技術(shù)，依賴預(yù)先制備的特異性抗體，需提前知道目標(biāo)蛋白，無法發(fā)現(xiàn)新的功能蛋白，且蛋白檢測(cè)通量低，難以覆蓋復(fù)雜組織的蛋白網(wǎng)絡(luò)；

其二，基于激光捕獲顯微切割結(jié)合液相色譜質(zhì)譜的技術(shù)，需要將組織切割成微小碎片后提取蛋白，再通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜鑒定。雖能非靶向分析，但無法保留組織的空間連續(xù)性，難以繪制整片組織的蛋白全景圖；且樣本分析通量低。

其三，傳統(tǒng) MALDI 質(zhì)譜成像雖能無標(biāo)記進(jìn)行非靶向分析，但受限于儀器分辨率和單像素點(diǎn)可檢測(cè)蛋白量，往往在 20-100μm 分辨率條件下識(shí)別小于 100 種蛋白質(zhì)。無法區(qū)分單細(xì)胞層、突觸等精細(xì)結(jié)構(gòu)，難以滿足精細(xì)組織的深度解析需求。

“我們需要一種技術(shù)，既能不依賴抗體發(fā)現(xiàn)新蛋白，又能保留組織空間的完整性，還能看清微米級(jí)的精細(xì)分布?！蓖貘P翔表示。

膨脹顯微鏡（expansion microscopy）通過讓組織在水凝膠中各向同性膨脹，從而在光學(xué)顯微鏡下看到更精細(xì)的結(jié)構(gòu)?！笆艽藛l(fā)，我們就在想，能不能把這個(gè)思路用到質(zhì)譜成像上？”

首先，把組織中的蛋白質(zhì)“錨定”在一張由水凝膠構(gòu)成的“網(wǎng)”里，并使其像泡發(fā)一樣物理膨脹 3-7 倍，拉大蛋白質(zhì)間距，并洗去小分子代謝物、脂質(zhì)干擾物質(zhì)，只留下“被放大了的蛋白質(zhì)地圖”。

接下來，用質(zhì)譜的激光逐點(diǎn)掃描放大后的組織。每個(gè)點(diǎn)被激光“拍打”后，會(huì)飛出離子，質(zhì)譜儀立即對(duì)這些離子進(jìn)行“稱重”，獲得一串“分子的重量條形碼”，即質(zhì)荷比?！巴ㄟ^對(duì)每個(gè)像素點(diǎn)信號(hào)的分析，我們既能知道有哪些分子，又能知道它們?cè)诮M織里的具體分布?！?/p>

（來源：Nature）

“簡單來說，iPEX 就像一個(gè)‘相機(jī)’加一個(gè)‘秤’的組合，既能一次性看到很多蛋白，又能保留它們?cè)诮M織中的精準(zhǔn)坐標(biāo)，從而在高分辨率和高通量之間找到一個(gè)平衡。”王鳳翔總結(jié)道。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，iPEX 的蛋白質(zhì)檢測(cè)靈敏度比傳統(tǒng) MALDI 提升 1-2 個(gè)數(shù)量級(jí)，有效像素尺寸可達(dá) 1-5μm，單樣本可檢測(cè) 600-1,500 種蛋白質(zhì)，且能同時(shí)捕捉蛋白的空間共定位關(guān)系。

iPEX 在真實(shí)場(chǎng)景中的三次“考試”

在為期三年半的研發(fā)過程中，王鳳翔和團(tuán)隊(duì)先后經(jīng)歷了三個(gè)階段：前一年半反復(fù)摸索技術(shù)流程，隨后一年進(jìn)行系統(tǒng)驗(yàn)證，最后一年聚焦于生物學(xué)機(jī)制探索。

為了檢驗(yàn) iPEX 的真實(shí)表現(xiàn)，他們讓這項(xiàng)技術(shù)在不同類型的樣本和模型中接受了三次“考試”。

看清精細(xì)結(jié)構(gòu)。在小鼠視網(wǎng)膜，iPEX 將有效像素尺寸（EPS）壓到約 4.8μm，能夠解析厚度僅 15–25μm 的突觸外層（OPL），檢測(cè)到 334 種（≥2 個(gè)獨(dú)特肽段）潛在蛋白，是傳統(tǒng)質(zhì)譜成像的約 16 倍。iPEX 繪出包括 CLTC 等突觸相關(guān)蛋白在 OPL 的特異性分布，以及 SAG、DYNC1H1 等標(biāo)志蛋白的分層定位，為精細(xì)神經(jīng)環(huán)路和視覺信號(hào)傳遞機(jī)制提供了蛋白水平的直接證據(jù)。

（來源：Nature）

驗(yàn)證通用性與穩(wěn)定性。小鼠小腦中，實(shí)現(xiàn) 3.9μm EPS，檢測(cè)到 640 種潛在蛋白，精準(zhǔn)區(qū)分顆粒層、分子層、小腦核等結(jié)構(gòu)；在小鼠腸道中，實(shí)現(xiàn) 2.4μm EPS，識(shí)別 1,001 種蛋白，像素聚類可自動(dòng)復(fù)現(xiàn)肌肉層、隱窩、絨毛結(jié)構(gòu)，且發(fā)現(xiàn)橋粒斑蛋白（DSP）在絨毛層的高表達(dá)；在 102 天成熟人源腦類器官中，檢測(cè)到 1241 種蛋白，精準(zhǔn)定位神經(jīng)上皮、神經(jīng)元等細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白的分布，為類器官發(fā)育研究提供蛋白水平的空間藍(lán)圖；在小鼠肝臟組織中，清晰識(shí)別中央靜脈結(jié)構(gòu)，且 3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中 92% 的肽段檢測(cè)一致，支持技術(shù)的穩(wěn)定性。

整體來看：在軟組織/硬組織/含腔結(jié)構(gòu)/類器官等不同場(chǎng)景下，iPEX 均能實(shí)現(xiàn)高分辨率、深覆蓋的蛋白檢測(cè)，單次實(shí)驗(yàn)可識(shí)別 600-1,500 種蛋白，靈敏度較傳統(tǒng)質(zhì)譜成像提升 10-100 倍。

（來源：Nature）

更重要的是，在阿爾茨海默?。ˋD）小鼠模型 5xFAD 中，iPEX 被用來回答一個(gè)關(guān)鍵問題：能否在典型病理之前看到更早的分子異常？

在已有明顯 Aβ 斑塊與認(rèn)知障礙的11 月齡 AD 小鼠中，iPEX 發(fā)現(xiàn)纖維束區(qū)域髓鞘堿性蛋白特征肽段顯著下降，提示髓鞘損傷具有明確空間特異性。多種線粒體功能相關(guān)蛋白異常，結(jié)合電鏡和活細(xì)胞成像，證實(shí)線粒體形態(tài)在早期即出現(xiàn)腫脹、嵴斷裂等改變。

在僅有少量 Aβ 沉積、行為尚未明顯異常的2 月齡AD小鼠中，iPEX 捕捉到 ACAA1（乙酰輔酶 A ?；D(zhuǎn)移酶 1）在纖維束、海馬、皮層等多個(gè)區(qū)域的特征肽段一致性下調(diào)。

（來源：Nature）

進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)顯示：ACAA1 功能受損會(huì)導(dǎo)致多種長鏈多不飽和脂肪酸（DHA、EPA、DPA、AA）水平下降，而以 C24 為主的極長鏈多不飽和脂肪酸異常積累；野生型 ACAA1 可恢復(fù)該紊亂，攜帶 AD 風(fēng)險(xiǎn)突變 N392S 的 ACAA1 則無法恢復(fù)。

這一系列證據(jù)支持：ACAA1 下調(diào)及相關(guān)脂質(zhì)代謝失衡，可能是 AD 進(jìn)程中的早期風(fēng)險(xiǎn)事件之一，而 iPEX 提供了鎖定這一空間-分子特征的技術(shù)手段。

仍在完善的初代技術(shù)

盡管 iPEX 展現(xiàn)出強(qiáng)大的潛力，但王鳳翔坦言，這項(xiàng)技術(shù)距離真正成熟仍有不少路要走。

首先是流程復(fù)雜。從樣本處理、膨脹到質(zhì)譜成像與數(shù)據(jù)分析，每個(gè)環(huán)節(jié)都涉及化學(xué)反應(yīng)與物理參數(shù)的精準(zhǔn)控制，操作步驟多、對(duì)規(guī)范性要求高，目前尚未實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和全流程標(biāo)準(zhǔn)化?！皥F(tuán)隊(duì)正在建立更簡化、可重復(fù)的操作體系，降低對(duì)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)的依賴?！?/p>

其次，蛋白鑒定精度仍有提升空間。目前 iPEX 主要依賴一級(jí)質(zhì)譜的質(zhì)量信息進(jìn)行多肽匹配，對(duì)同分異構(gòu)體或質(zhì)量相近分子區(qū)分能力有限。未來，團(tuán)隊(duì)計(jì)劃結(jié)合高分辨率質(zhì)譜儀和二級(jí)質(zhì)譜聯(lián)合檢測(cè)策略，進(jìn)一步提高蛋白鑒定的準(zhǔn)確度與覆蓋度。

第三，數(shù)據(jù)體量巨大。以約 50μm 的像素分辨率掃描整腦樣本，單張腦片就可能產(chǎn)生數(shù)百 GB 數(shù)據(jù)，對(duì)計(jì)算、存儲(chǔ)與分析提出極高要求。王鳳翔介紹，團(tuán)隊(duì)正開發(fā)更友好的數(shù)據(jù)處理流程和軟件平臺(tái)，力求實(shí)現(xiàn)“從原始信號(hào)到蛋白圖譜的一鍵生成”。

最后，推廣門檻較高。質(zhì)譜成像設(shè)備昂貴，計(jì)算資源需求大，目前 iPEX 更適合在具備高端平臺(tái)的科研機(jī)構(gòu)率先應(yīng)用。團(tuán)隊(duì)希望通過實(shí)驗(yàn)流程的標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化，逐步降低使用門檻，讓更多實(shí)驗(yàn)室能夠應(yīng)用這一技術(shù)。

未來，研究團(tuán)隊(duì)計(jì)劃從基礎(chǔ)研究產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化與臨床應(yīng)用兩條主線推進(jìn) iPEX 的應(yīng)用。

在基礎(chǔ)研究層面，iPEX 首次實(shí)現(xiàn)了“微米級(jí)分辨率 + 深蛋白覆蓋”的原位分析，使科學(xué)家能夠直接觀察蛋白質(zhì)在精細(xì)組織（如突觸、單細(xì)胞層）中的分布規(guī)律。這將為解析神經(jīng)環(huán)路的構(gòu)建、組織穩(wěn)態(tài)維持及胚胎發(fā)育等生命過程提供可視化證據(jù)。

在臨床轉(zhuǎn)化層面，基于 iPEX 發(fā)現(xiàn)的 AD 早期 ACAA1 蛋白紊亂，探索其在臨床診斷中的應(yīng)用，及脂肪酸干預(yù)策略在 AD 早期治療中的轉(zhuǎn)化潛力。此外，團(tuán)隊(duì)計(jì)劃進(jìn)一步優(yōu)化技術(shù)適配性，應(yīng)用于臨床患者樣本，解析疾病在人體中的紊亂特征，助力臨床診斷及治療。

“iPEX 目前還是一項(xiàng)初代技術(shù)，我們希望把流程做穩(wěn)定、做標(biāo)準(zhǔn)，能夠讓它真正走向臨床?！蓖貘P翔說。

1.Wang, F., Sun, C., Wu, T.W. et al. iPEX enables micrometre-resolution deep spatial proteomics via tissue expansion. Nature (2025). https://doi.org/10.1038/s41586-025-09734-0

運(yùn)營/排版：何晨龍