“我們成功研發(fā)了世界上第一例固載化的類核糖體分子反應(yīng)器（RMMR，Ribosome-Mimicking Molecular Reactor），并一舉攻克了結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)密集 N-Me 氨基酸或 α,α-二取代氨基酸的高空間位阻多肽的高效固相合成和自動(dòng)化機(jī)器合成技術(shù)?！蹦暇┐髮W(xué)教授姚祝軍告訴 DeepTech。

圖 | 姚祝軍（來源：姚祝軍）

可能是幾十年來 SPPS 領(lǐng)域?yàn)閿?shù)不多的重大突破之一

很多人都知道，生物學(xué)“中心法則”中 RNA 翻譯到蛋白質(zhì)這一過程發(fā)生在核糖體。翻譯時(shí)，核糖體小亞基先與從細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄得到的信使 RNA 結(jié)合，讀取 mRNA 信息再結(jié)合核糖體大亞基構(gòu)成完整的核糖體，將轉(zhuǎn)運(yùn) RNA 運(yùn)送的氨基酸分子合成多肽。在本次研究中，該團(tuán)隊(duì)把核糖體視作一架巨大的多肽制造“分子機(jī)器”，經(jīng)不斷的思考、討論和修正，逐步形成了一種“跳出傳統(tǒng) Merrifield SPPS 習(xí)慣思維”的新思路：即模擬核糖體的蛋白質(zhì)翻譯過程，使類似的“肽?！焙汀鞍滨?tRNA”單元相互靠近并發(fā)生分子內(nèi)“ON”酰基轉(zhuǎn)移而形成目標(biāo)肽鍵，克服現(xiàn)有 SPPS 技術(shù)在反應(yīng)原理上掙扎的效率困境。

RMMR 分子反應(yīng)器包含兩個(gè)關(guān)鍵部分：一個(gè)多肽合成把手區(qū)（模擬肽酰 tRNA）和數(shù)個(gè)?；罨瘏^(qū)（模擬氨酰 tRNA）。將其固定至商用樹脂表面即成為可循環(huán)運(yùn)作的反應(yīng)平臺(tái)。RMMR SPPS 通過 RMMR 反應(yīng)平臺(tái)進(jìn)行氨基酸活化并快速與多肽鏈 N 端氨基發(fā)生“偽均相”?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，從根源上解決了傳統(tǒng) SPPS 兩相間?；D(zhuǎn)移的低效率問題。這種由可循環(huán)工作的分子機(jī)器實(shí)施的目標(biāo)肽鍵形成方案，就像換了一個(gè)賽道完全顛覆了傳統(tǒng) Merrifield SPPS 合成的工作原理和反應(yīng)模式。同時(shí)，這種迭代 RMMR 方法也承接了傳統(tǒng) SPPS 在氨基酸活化酯方面的部分成就，賦予其操控反應(yīng)的“開/關(guān)”控制：商用的 N-Fmoc 氨基酸與溫和廉價(jià)縮合劑 DIC 所形成的活性中間體將 RMMR 樹脂上的活化功能區(qū)“turn on”，隨后根據(jù)空間鄰近效應(yīng)介導(dǎo)發(fā)生分子反應(yīng)器“內(nèi)/間”快速?；D(zhuǎn)移，從而形成目標(biāo)酰胺鍵；而那些前一流程未被反應(yīng)掉的活化功能區(qū)則在隨后哌啶處理支載多肽末端 N-Fmoc 保護(hù)基的同時(shí)也被“turn off”，準(zhǔn)備好迎接下一輪氨基酸的縮合循環(huán)。這一過程不僅可以實(shí)現(xiàn)高度的可重復(fù)運(yùn)作，而且操控十分簡(jiǎn)單，因此適配于自動(dòng)化多肽合成平臺(tái)。

（來源：Nature Chemistry）

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RMMR SPPS 方法能以高至 98% 的效率合成含 N-甲基和 α，α-雙取代兩類大位阻氨基酸的多肽序列。在多種常見的 N-甲基氨基酸/α，α-雙取代氨基酸位置前后均可高效縮合不同性質(zhì)的氨基酸，前/后相對(duì)位置不影響縮合效率；同時(shí)，序列中可連續(xù)或非連續(xù)地高效縮合多個(gè)大位阻氨基酸。該方法還首次實(shí)現(xiàn)了同時(shí)存在兩種類型大位阻氨基酸的多肽序列的高效縮合，并以 90% 效率完成了難度極大的“Aib-NMeVal”型酰胺鍵的形成。

此次新技術(shù)在多種具有重要生理活性的大位阻多肽天然產(chǎn)物的固相合成中展現(xiàn)出色優(yōu)勢(shì)。例如，采用 RMMR SPPS 的 cyclosporin A 類似物合成范例顯示，其中含有 7 個(gè) N-Me 氨基酸的鏈狀 11 肽粗產(chǎn)品的純度可達(dá) 88%，分離純化產(chǎn)率可達(dá) 70%，大大超越了現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果。范例中還包括了抗菌肽 alamethicin F 衍生物的 RMMR SPPS，該二十肽序列中包含了八個(gè) α-甲基丙氨酸（Aib）殘基，其機(jī)器自動(dòng)化合成的粗產(chǎn)品純度可達(dá) 88%，分離純化后產(chǎn)率為 73%，結(jié)果相當(dāng)驚艷。

總而言之，RMMR SPPS 創(chuàng)新技術(shù)籍由迭代科學(xué)思維，突破了 60 多年來傳統(tǒng)固相多肽合成法無法克服的原理性限制，實(shí)現(xiàn)了溫和條件下高空間位阻難合成肽鏈的高效組裝，是一項(xiàng)在多肽固相合成和自動(dòng)化合成領(lǐng)域具有里程碑意義的重大突破。RMMR SPPS 技術(shù)可望極大加速含有 N -甲基化和 α，α-雙取代氨基酸的多肽藥物探索，為未來口服及作用于細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)的肽類藥物候選分子的發(fā)現(xiàn)和生物相容性材料的研究開發(fā)帶來重大突破機(jī)遇。

審稿人評(píng)價(jià)稱：“該概念簡(jiǎn)單且巧妙，依賴于一種量身定制的聚合物固體支持物，其中樹枝狀四價(jià) HOBt 或 Oxyma? 衍生物被接枝到固體支持物的上游，用于錨定和延長(zhǎng)待延伸的肽鏈的可裂解連接體。HOBt 衍生物和 Oxyma? 都是經(jīng)典添加劑（或偶聯(lián)劑如 HBTU 或 COMU 等許多其他偶聯(lián)劑的亞組分），用于形成氨?；罨ィ@些活化酯是當(dāng)前大多數(shù) SPPS 方案中酰胺形成偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)物，通過 O-N 酰基轉(zhuǎn)移從溶液相轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)肽鏈的固體支持胺中?！?/p>

審稿人還表示：“與使用傳統(tǒng) SPPS 方案相比，結(jié)果絕對(duì)令人震驚且具有說服力，當(dāng)合成的肽含有 N-甲基化或季銨氨基酸時(shí)，其粗品純度得到了顯著且大幅度的提升。在我看來，這極有可能是幾十年來 SPPS 領(lǐng)域?yàn)閿?shù)不多的重大突破之一，其技術(shù)突破程度或許可與 Fmoc-SPPS 的發(fā)明或 ChemMatrix、PEGA 等極性樹脂的開發(fā)相媲美。從這個(gè)意義上說，我認(rèn)為這一新概念的發(fā)明非常具有價(jià)值且值得在Nature Chemistry這一頂尖化學(xué)期刊上發(fā)表?！?/p>

姚祝軍表示，RMMR SPPS 不僅可以高效合成各種高空間位阻多肽，而且全面兼容現(xiàn)有 Merrifield SPPS 涉及的所有工作范圍，包括自動(dòng)化儀器平臺(tái)，這兩種技術(shù)在操作中還可以實(shí)現(xiàn)自由切換使用。因此，RMMR SPPS 的原理與技術(shù)在一定意義上可以稱作是新一代或迭代固相合成技術(shù)。

RMMR SPPS 新技術(shù)將會(huì)在以下幾個(gè)方面帶來巨大機(jī)遇：1）肽藥設(shè)計(jì)的范圍將被拓展，將能觸及到以前不可能獲得的化合物禁區(qū)；2）現(xiàn)有具有先天缺陷的肽藥將獲得新的優(yōu)化機(jī)會(huì)，比如提升藥物口服利用度等；3）賦予研究者逐鹿肽類藥物跨膜靶向胞內(nèi)受體的各種機(jī)會(huì)；4）能夠融合 AI 技術(shù)研制新一代 SPPS 自動(dòng)化合成（實(shí)驗(yàn)室）儀器平臺(tái)。

（來源：Nature Chemistry）

惡名昭著的頭號(hào)“難肽”

多肽和蛋白質(zhì)是生命體最重要的基礎(chǔ)物質(zhì)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)由各個(gè)氨基酸通過肽鍵（酰胺鍵）依次相連而形成。由于分子內(nèi)和分子間的氫鍵等非鍵相互作用而發(fā)生局部結(jié)構(gòu)扭轉(zhuǎn)或形成折疊，最終成為各式各樣具有不同三維結(jié)構(gòu)的生理功能物質(zhì)。肽類藥物因其生物相容性等優(yōu)勢(shì)近年來受到重點(diǎn)關(guān)注且發(fā)展迅速，但同時(shí)也受到其固有的代謝穩(wěn)定性和透膜性差的嚴(yán)重制約。研究顯示，在肽骨架中引入 N-甲基或 α-烷基化氨基酸可明顯改善化學(xué)穩(wěn)定性和膜通透性，從而增強(qiáng)肽類化合物的“成藥性”。當(dāng)今風(fēng)靡全球的降糖減重藥物“司美格魯肽（Semaglutide）”就是天然的人胰高糖素樣肽-1（GLP-1，glucagon-like peptide-1）的結(jié)構(gòu)修飾物，其中的化學(xué)改造就包括在結(jié)構(gòu)中插入了一個(gè) α-烷基化氨基酸（Aib,U）來延長(zhǎng)代謝半衰期，由于效果極為明顯其成為了一例新型長(zhǎng)效的胰高糖素樣肽-1 受體激動(dòng)劑，被用于了成人 2 型糖尿病患者的血糖控制。

當(dāng)前，絕大多數(shù)的多肽都可通過美國(guó)著名生物化學(xué)家布魯斯·梅里菲爾德（Bruce Merrifield）于 1963 年首創(chuàng)發(fā)明的多肽固相合成法（SPPS，solid-phase peptide synthesis）制備獲得，且可實(shí)現(xiàn)工業(yè)規(guī)模的自動(dòng)化機(jī)器合成。Merrifield 因此也獲得 1984 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。但是，Merrifield SPPS 固液兩相間的傳質(zhì)效率十分低下，導(dǎo)致關(guān)鍵的?；D(zhuǎn)移動(dòng)力學(xué)性質(zhì)較差，在技術(shù)上每步都需要使用大大過量的化學(xué)試劑和活化劑來幫助反應(yīng)效率達(dá)標(biāo)，經(jīng)濟(jì)性和綠色化學(xué)目標(biāo)都非常不佳。并且，Merrifield SPPS 方法無法實(shí)現(xiàn)上述二類空間大位阻多肽序列的合成。過去六十多年間，一代又一代科研學(xué)者通過前赴后繼的努力提供了無數(shù)的改進(jìn)方案，均無法獲得突破，空間大位阻多肽的固相合成成為多肽合成化學(xué)領(lǐng)域惡名昭著的頭號(hào)“難肽”。該合成化學(xué)層面的長(zhǎng)期困惑嚴(yán)重制約了現(xiàn)代新藥研究和藥物工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)的前行步伐。為了解決這一問題，該團(tuán)隊(duì)開展了本次研究。

（來源：Nature Chemistry）

多肽合成化學(xué)“拔釘子”行動(dòng)

據(jù)介紹，2019 年春由該團(tuán)隊(duì)的劉發(fā)博士和姚祝軍作為課題發(fā)起人開始討論多肽合成中公認(rèn)的幾個(gè)難題，該團(tuán)隊(duì)稱之為多肽合成化學(xué)“拔釘子”行動(dòng)。第一個(gè)目標(biāo)就是大空間位阻多肽的肽鍵形成問題。他們認(rèn)為傳統(tǒng)技術(shù)的優(yōu)化通道很窄，六十多年來有可能的改進(jìn)都應(yīng)該被研究過了，結(jié)論是至今無法突破。因此，該團(tuán)隊(duì)認(rèn)為必須換思路、換賽道，于是開始有了模擬核糖體功能的想法。最后形成了類核糖體方案，提出了分子機(jī)器的概念。2019 年 9 月，魏思媛同學(xué)（本次論文第一作者）從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)畢業(yè)作為五年制免試直博生來南京大學(xué)報(bào)到，課題才正式開始啟動(dòng)?！捌陂g，魏思媛同學(xué)展示了超強(qiáng)的學(xué)習(xí)和領(lǐng)悟能力、實(shí)驗(yàn)動(dòng)手能力和結(jié)果分析能力，以及作為湖南妹子的堅(jiān)忍和毅力。在她的不懈努力下，‘關(guān)關(guān)難過關(guān)關(guān)過’，最終課題獲得全面突破?！币ψ＼姳硎?。

隨后，他們?cè)诜肿釉O(shè)計(jì)階段拿出了好幾套潛在方案，但其實(shí)他們并沒有能力判斷哪一種是最好的，只好由魏思媛自己挑一套開始?！坝浀盟鋈粺o措了好幾天，決定像摸彩票。”姚祝軍回憶稱。由于目前的理論性預(yù)測(cè)能力不足以支持前期預(yù)判，堆積“搬磚”工作量是唯一的途徑。每一批數(shù)據(jù)出來之后，他們都要仔細(xì)分析規(guī)律，隨后針對(duì)設(shè)計(jì)進(jìn)行了一次次優(yōu)化，然后繼續(xù)驗(yàn)證……這個(gè)過程非?？简?yàn)課題組的耐心，很多數(shù)據(jù)在出現(xiàn)時(shí)非常無序，他們的心情也隨之高低起伏，有時(shí)候晚上焦慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果而睡不著覺。經(jīng)過四輪優(yōu)化，終于獲得了比較滿意且符合規(guī)律的結(jié)果?！邦A(yù)期的分子機(jī)器概念曙光乍現(xiàn)，感覺像要開啟成功之門了?！币ψ＼娬f道。

接著，他們把經(jīng)過優(yōu)化之后的固載化 RMMR 分子機(jī)器用于“開/關(guān)”操作的動(dòng)力學(xué)行為研究，確認(rèn)了可操作性。然后，經(jīng)過設(shè)定實(shí)驗(yàn)的對(duì)比，驗(yàn)證了類核糖體的酰基轉(zhuǎn)移機(jī)制的真實(shí)存在；RMMR SPPS 具備普通多肽、長(zhǎng)肽的合成能力，并與傳統(tǒng) SPPS 效果相當(dāng)。然后，他們選擇個(gè)別代表性高空間位阻多肽進(jìn)行合成，并與傳統(tǒng) SPPS 進(jìn)行了效果比較。結(jié)果非常令人欣慰，RMMR SPPS 顯示出驚人的合成優(yōu)勢(shì)，甚至超越了該團(tuán)隊(duì)的預(yù)期。到此，該團(tuán)隊(duì)感覺他們已經(jīng)勝利在望，或者已經(jīng)處在“開創(chuàng)新紀(jì)元”的征程之中。隨后的底物擴(kuò)展性研究也非常順利，范例一次次證明 RMMR SPPS 的驚人優(yōu)勢(shì)效果；機(jī)器自動(dòng)化合成也非常順利?！拔核兼潞蛷埿旒兺瑢W(xué)自己修訂了商品化儀器設(shè)備自帶的程序包，在實(shí)驗(yàn)范例研究中獲得了優(yōu)異的效果?！币ψ＼娀貞浄Q。

與此同時(shí)，在檢驗(yàn)氨基酸消旋化程度的過程中，他們一度發(fā)現(xiàn)新方法在耦合組氨酸 His 時(shí)發(fā)生較為明顯的消旋化，比傳統(tǒng) SPPS 要高出不少，顯然這是非常不利的結(jié)果。為此，他們花了不少時(shí)間做各種嘗試，最終發(fā)現(xiàn) RMMR SPPS 和 Merrifield SPPS 條件之間是可以隨意切換的，并不影響氨基酸耦合的效果。如此一來，他們采用按需切換條件的方式不僅解決了 His 偶聯(lián)中少量消旋化的問題，還進(jìn)一步展示了新技術(shù)的變通性和易操作性?！八^，研究中出現(xiàn)的異常往往是又一次新的發(fā)現(xiàn)機(jī)會(huì)?！币ψ＼姳硎尽Ｍ瑫r(shí)，該團(tuán)隊(duì)也為本次新技術(shù)申請(qǐng)了中國(guó)發(fā)明專利和國(guó)際專利的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)。

（來源：Nature Chemistry）

前面提到，研究者的毅力和堅(jiān)持對(duì)于課題的成功是十分關(guān)鍵的因素。研究過程中大多數(shù)時(shí)間都是令人失望的結(jié)果，尤其在本次研究的初期充斥著體力和精神的雙重煎熬。魏思媛（現(xiàn)已經(jīng)博士畢業(yè)）在 2023 年秋季和姚祝軍曾有過一次交流，那時(shí)研究工作大體已經(jīng)成型，但尚需要征服個(gè)別公認(rèn)的“硬骨頭”，比如含有密集 N-Me 氨基酸的環(huán)肽藥物——環(huán)孢菌素 A 的 RMMR SPPS 合成，如能攻克則可提升這一方案的科學(xué)高度。“但這樣的話，她就有可能無法參加原定于 2024 年 5 月組織的畢業(yè)答辯。她希望就此打住。我拒絕了這一請(qǐng)求，并希望她突破這一難題。她當(dāng)時(shí)情緒很大，半夜向父母哭訴，把她父母嚇壞了……最終，她還是堅(jiān)持住了，調(diào)整情緒投入到工作中。后來的實(shí)驗(yàn)工作表明，這一難肽的合成工作并沒有想象中的艱難，RMMR SPPS 像一把神器，迅速破解了這一難題?！币ψ＼姳硎尽：髞?，魏思媛順利按時(shí)完成了畢業(yè)論文答辯，并獲得了答辯專家組全優(yōu)的高度評(píng)價(jià)?！拔乙蚕Ｍ源伺c讀者們一起共勉，原創(chuàng)性研究工作不僅考驗(yàn)著研究者的智慧和實(shí)踐能力，更考驗(yàn)導(dǎo)師和學(xué)生的精神毅力?！币ψ＼娍偨Y(jié)稱。

最終，相關(guān)論文以《固定酰基轉(zhuǎn)移分子反應(yīng)器可實(shí)現(xiàn)空間受阻肽的固相合成》（Immobilized acyl-transfer molecular reactors enable the solid-phase synthesis of sterically hindered peptides）為題發(fā)在Nature Chemistry，姚祝軍和劉發(fā)擔(dān)任共同通訊作者 [1]。

圖 | 相關(guān)論文（來源：Nature Chemistry）

如前所述，該團(tuán)隊(duì)最初的開題討論瞄準(zhǔn)了幾個(gè)長(zhǎng)久沒有克服的多肽領(lǐng)域合成化學(xué)難題，他們自己將這調(diào)侃為多肽合成化學(xué)的“拔釘子”行動(dòng)。在開創(chuàng) RMMR SPPS 概念并突破空間大位阻多肽的固相合成與自動(dòng)化合成之后，他們希望進(jìn)一步深化和延伸，爭(zhēng)取拔除第二枚著名的”釘子”——易簇集多肽的固相自動(dòng)化合成及產(chǎn)品分離純化難題。二者的原理有所不同，但現(xiàn)有 RMMR SPPS 經(jīng)變通發(fā)展有望解決第二個(gè)難題；目前，該團(tuán)隊(duì)這方面也已經(jīng)取得了部分的階段性進(jìn)展。此外，該團(tuán)隊(duì)也在布局利用 RMMR SPPS 技術(shù)設(shè)計(jì)制造新型雜合形式的高空間位阻多肽，以達(dá)到優(yōu)秀的細(xì)胞膜透性和代謝穩(wěn)定性。所有這些努力將續(xù)寫迭代 RMMR SPPS 的技術(shù)威力，以拓展具有重要生理學(xué)意義的多肽的自動(dòng)化合成版圖助力現(xiàn)代肽藥研究。

參考資料：

1.Wei, S., Zhang, X., Yang, X. et al. Immobilized acyl-transfer molecular reactors enable the solid-phase synthesis of sterically hindered peptides.Nat. Chem.(2025). https://doi.org/10.1038/s41557-025-01896-8

運(yùn)營(yíng)/排版：何晨龍