糖尿病是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡和殘疾的主要原因之一，患者人數(shù)預(yù)計(jì)到2050年將達(dá)13.1億。目前，糖尿病管理主要依賴(lài)血糖監(jiān)測(cè)、嚴(yán)格飲食控制及每日多次胰島素注射，但這些方法不僅給患者帶來(lái)沉重的治療負(fù)擔(dān)和心理壓力，還難以有效控制血糖波動(dòng)?，F(xiàn)有長(zhǎng)效胰島素如甘精胰島素和icodec雖能減少注射頻率，但其作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易導(dǎo)致低血糖風(fēng)險(xiǎn)，且合成工藝復(fù)雜、成本高昂。此外，已有葡萄糖響應(yīng)性胰島素制劑因聚合物毒性、胰島素釋放不穩(wěn)定等問(wèn)題，限制了其臨床應(yīng)用。

近日，華東理工大學(xué)劉潤(rùn)輝教授課題組研究開(kāi)發(fā)出一種新型葡萄糖響應(yīng)性胰島素制劑，通過(guò)皮下注射可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效血糖控制。該制劑由重組人胰島素與雙胍功能化聚（2-惡唑啉）聚合物復(fù)合而成，聚合物進(jìn)一步修飾苯硼酸基團(tuán)，使其能在高血糖條件下通過(guò)靜電作用變化釋放胰島素。在I型糖尿病迷你豬模型中，單次注射該復(fù)合物可維持正常血糖超過(guò)192小時(shí)，且?guī)缀跷从^察到低血糖事件，顯示出優(yōu)異的生物相容性和治療潛力。相關(guān)論文以“Poly(bis(guanidinium)-oxazoline)–Insulin Complex Exerting Long-Acting Glucose-Responsive Insulin Release in Mice and Minipigs”為題，發(fā)表在

JACS

研究人員首先設(shè)計(jì)了具有雙胍基團(tuán)的聚（2-惡唑啉）聚合物（Pox-BiGua），并通過(guò)引入氟苯硼酸（FPBA）賦予其葡萄糖響應(yīng)性。合成過(guò)程中，聚合物鏈長(zhǎng)控制精確，分散度窄，經(jīng)核磁共振和凝膠滲透色譜驗(yàn)證結(jié)構(gòu)一致。該系列聚合物（BiGuaxFPBAy）在細(xì)胞毒性及溶血實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的生物相容性，IC50值超過(guò)400 μg/mL，遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)聚賴(lài)氨酸（PLL）材料。

圖1. 葡萄糖響應(yīng)性聚合物-胰島素復(fù)合物的設(shè)計(jì) （a）通過(guò)雙胍和氟苯硼酸（FPBA）功能化設(shè)計(jì)具有增強(qiáng)胰島素負(fù)載能力和穩(wěn)定性的葡萄糖響應(yīng)性聚合物。帶正電的雙胍功能化聚（2-惡唑啉）聚合物與帶負(fù)電的胰島素形成強(qiáng)靜電相互作用，獲得葡萄糖響應(yīng)性胰島素復(fù)合物。 （b）葡萄糖響應(yīng)性胰島素復(fù)合物中電荷減少的機(jī)制及其在高血糖條件下主導(dǎo)胰島素釋放的作用。 （c）BiGua70FPBA30?胰島素復(fù)合物在STZ誘導(dǎo)的I型糖尿病迷你豬中表現(xiàn)出強(qiáng)效治療效果，單次給藥后維持正常血糖超過(guò)192小時(shí)。

圖2. 聚合物合成與體外生物相容性 （a）雙胍功能化聚（2-惡唑啉）（Pox-BiGua）和FPBA修飾的Pox-BiGua（BiguaxFPBAy）的合成路線。 （b）側(cè)鏈NH-Boc保護(hù)階段的P(ProNHBocOx)20的凝膠滲透色譜（GPC）表征。 （c）和（d）Pox-BiGua和BiguaxFPBAy在D2O中的質(zhì)子核磁共振（1H NMR）譜圖。 （e）BiGuaxFPBAy對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（NIH-3T3）的細(xì)胞毒性。 （f）BiGuaxFPBAy對(duì)新鮮紅細(xì)胞的溶血作用。

通過(guò)密度泛函理論計(jì)算發(fā)現(xiàn)，雙胍基團(tuán)與胰島素B鏈上的谷氨酸殘基之間具有最強(qiáng)的氫鍵作用和結(jié)合能，顯著提升了胰島素負(fù)載效率至97%以上。與僅含氨基的聚合物相比，雙胍功能化聚合物在PBS中幾乎不釋放胰島素，表現(xiàn)出極高的復(fù)合物穩(wěn)定性。進(jìn)一步研究顯示，F(xiàn)PBA的引入使復(fù)合物在高葡萄糖濃度下釋放胰島素量顯著增加，體現(xiàn)出明確的葡萄糖響應(yīng)特性。

圖3. 不同聚合物的胰島素結(jié)合與葡萄糖響應(yīng)釋放研究 （a）聚賴(lài)氨酸、Pox-C3?NH2和Pox-BiGua的胰島素負(fù)載能力。 （b）Pox-C3?NH2?胰島素復(fù)合物和Pox-BiGua?胰島素復(fù)合物在PBS緩沖液中的穩(wěn)定性。 （c）BiGuaxFPBAy的胰島素負(fù)載效率。 （d）苯硼酸的葡萄糖依賴(lài)平衡。 （e–i）BiGuaxFPBAy?胰島素復(fù)合物在0、100和400 mg/dL葡萄糖濃度下的葡萄糖響應(yīng)性胰島素釋放。

在優(yōu)化配方中，BiGua70FPBA30?胰島素復(fù)合物表現(xiàn)出最佳的穩(wěn)定性和響應(yīng)性。該復(fù)合物呈膠體狀，粒徑約200納米，隨時(shí)間逐漸聚集至微米級(jí)。其疏松多孔的結(jié)構(gòu)有利于葡萄糖和胰島素的快速擴(kuò)散與交換。隨著葡萄糖濃度升高，復(fù)合物的ζ電位逐漸降低，表明葡萄糖結(jié)合導(dǎo)致正電荷密度下降，從而觸發(fā)胰島素釋放。該復(fù)合物還實(shí)現(xiàn)了多次脈沖式釋放，并在4°C儲(chǔ)存90天后仍保持響應(yīng)活性，釋放的胰島素二級(jí)結(jié)構(gòu)完整。

圖4. BiGua70FPBA30?胰島素復(fù)合物的表征、電荷切換、葡萄糖結(jié)合及長(zhǎng)期儲(chǔ)存有效性 （a）FITC-BiGua70FPBA30（黃色）和RhB-胰島素（紅色）及復(fù)合物的代表性圖像。 （b）倒置熒光顯微鏡下的復(fù)合物圖像。 （c）和（d）復(fù)合物的代表性TEM和SEM圖像。 （e）動(dòng)態(tài)光散射測(cè)得的流體動(dòng)力學(xué)尺寸分布。 （f）復(fù)合物在不同葡萄糖濃度下的ζ電位。 （g）復(fù)合物在不同葡萄糖濃度下的葡萄糖結(jié)合能力。 （h）通過(guò)葡萄糖濃度交替（400?100 mg/dL）實(shí)現(xiàn)復(fù)合物的脈沖式胰島素釋放。 （i）復(fù)合物在4°C儲(chǔ)存90天后在0、100和400 mg/dL葡萄糖濃度下的胰島素釋放能力。 （j）原始胰島素與復(fù)合物釋放的胰島素的圓二色譜。

在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，復(fù)合物皮下注射后胰島素滯留時(shí)間顯著延長(zhǎng)，48小時(shí)后仍可檢測(cè)到熒光信號(hào)，而游離胰島素在1–2小時(shí)內(nèi)即被清除。復(fù)合物能迅速將血糖降至正常范圍并維持近48小時(shí)，效果遠(yuǎn)超天然胰島素和甘精胰島素。在葡萄糖耐量測(cè)試中，復(fù)合物處理組血糖峰值較低且恢復(fù)更快，同時(shí)伴隨血漿胰島素水平的迅速上升與回落，體現(xiàn)出良好的葡萄糖響應(yīng)能力。即使在高劑量（275 U/kg）下，復(fù)合物仍能維持正常血糖超過(guò)120小時(shí)，且未引發(fā)低血糖事件。

圖5. BiGua70FPBA30?胰島素復(fù)合物的體內(nèi)滯留及聚合物生物分布 （a）小鼠皮下注射復(fù)合物與天然胰島素后胰島素的滯留情況。 （b）注射后熒光強(qiáng)度定量。 （c）糖尿病小鼠接受天然胰島素或復(fù)合物治療后的血糖水平。 （d）皮下注射復(fù)合物后BiGua70FPBA30的生物分布。 （e–i）復(fù)合物注射后BiGua70FPBA30在小鼠心、肺、脾、肝、腎中的分布。

圖6. BiGua70FPBA30?胰島素復(fù)合物在I型糖尿病小鼠模型中的治療潛力 （a）實(shí)驗(yàn)分組與處理方案。 （b）和（c）小鼠接受天然胰島素、甘精胰島素或復(fù)合物治療后的血糖水平與正常血糖持續(xù)時(shí)間。 （d）和（e）治療后3小時(shí)腹腔葡萄糖耐量測(cè)試（IPGTT）結(jié)果及曲線下面積（AUC）統(tǒng)計(jì)。 （f）體內(nèi)葡萄糖注射觸發(fā)的胰島素釋放。 （g）和（h）高劑量（275 U/kg）下各組血糖水平與正常血糖持續(xù)時(shí)間。 （i）和（j）治療后3小時(shí)和4天的IPGTT結(jié)果。 （k）IPGTT的AUC統(tǒng)計(jì)。

在迷你豬模型中，復(fù)合物同樣表現(xiàn)出色。通過(guò)連續(xù)血糖監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可見(jiàn)，單次注射后迷你豬血糖在168至192小時(shí)內(nèi)維持在正常范圍內(nèi)，且血糖波動(dòng)極小。與甘精胰島素相比，復(fù)合物組低血糖事件發(fā)生率更低。此外，注射后血漿胰島素水平隨血糖升高而顯著上升，進(jìn)一步驗(yàn)證了其在體內(nèi)的葡萄糖響應(yīng)釋放機(jī)制。

圖7. BiGua70FPBA30?胰島素復(fù)合物在I型糖尿病迷你豬中的治療潛力 （a）迷你豬動(dòng)態(tài)血糖監(jiān)測(cè)示意圖。 （b）復(fù)合物在迷你豬中的葡萄糖響應(yīng)性胰島素釋放。 （c）健康迷你豬24小時(shí)內(nèi)代表性血糖軌跡。 （d）未治療糖尿病迷你豬24小時(shí)內(nèi)血糖軌跡。 （e）甘精胰島素治療48小時(shí)內(nèi)的血糖軌跡。 （f）復(fù)合物單次注射后血糖軌跡。

生物安全性評(píng)估顯示，BiGua70FPBA30及其胰島素復(fù)合物在小鼠中均未引起明顯毒性反應(yīng)。最大耐受劑量實(shí)驗(yàn)中所有小鼠存活，重復(fù)給藥后體重、血生化指標(biāo)及組織病理學(xué)結(jié)果均未見(jiàn)異常，注射部位也無(wú)明顯中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)或纖維化，表明該制劑具有良好的體內(nèi)安全性。

圖8. BiGua70FPBA30聚合物及胰島素復(fù)合物的體內(nèi)毒性評(píng)價(jià) （a）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組。 （b）重復(fù)皮下注射后小鼠體重變化。 （c–i）血生化指標(biāo)（ALT、AST、BUN、CREA、Na+、Cl?、K+）結(jié)果。 （j）和（k）心、肝、脾、肺、腎組織的H&E染色切片。

綜上所述，該研究成功開(kāi)發(fā)出一種基于雙胍功能化聚合物的葡萄糖響應(yīng)性胰島素復(fù)合物，能實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效、可控的胰島素釋放，并在小鼠和迷你豬模型中驗(yàn)證了其優(yōu)異的血糖控制能力與生物安全性。未來(lái)，該制劑有望與可注射水凝膠或可回收植入物結(jié)合，實(shí)現(xiàn)超長(zhǎng)效胰島素輸送，為糖尿病治療提供新的解決方案。進(jìn)一步的臨床轉(zhuǎn)化研究將聚焦于劑量?jī)?yōu)化與個(gè)體化治療方案。