L-谷氨酰胺為何對于細(xì)胞培養(yǎng)如此重要？

L-谷氨酰胺是一種常見的無血清培養(yǎng)基補(bǔ)充劑，用于生物制造應(yīng)用、組織工程、雜交瘤培養(yǎng)等特種細(xì)胞培養(yǎng)以及其他常見哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用。然而，由于 L-谷氨酰胺是一種不穩(wěn)定的必需氨基酸，因此大多數(shù)商業(yè)化的無L-谷氨酰胺培養(yǎng)基配方不是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方中包含了L-谷酰胺，就是需要在使用時在液體培養(yǎng)基里添加。

我們提供用于細(xì)胞培養(yǎng)的谷氨酰胺二肽或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。幾種生物制造領(lǐng)域?qū)Ｓ门囵B(yǎng)基添加的是二肽形式的L-谷氨酰胺，比如丙氨酰L-谷氨酰胺和甘氨酰L-谷氨酰胺。另一種還有待進(jìn)一步研究的L-谷氨酰胺來源是蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，尤其是麩質(zhì)水解產(chǎn)物。如需無血清或無動物蛋白培養(yǎng)基，例如培養(yǎng)重組中國倉鼠卵巢細(xì)胞 (rCHO)時，小麥麩質(zhì)是豐富的肽基谷氨酰胺來源。

作為經(jīng)典細(xì)胞培養(yǎng)基中的補(bǔ)充物，L-谷氨酰胺濃度從Ames培養(yǎng)基的0.5 mM到MCDB 培養(yǎng)基131的10 mM 不等。生物制造和組織工程應(yīng)用中用到的濃度通常為 2 到4 mM。

DMEM/F12 營養(yǎng)混合物中的最佳 L-谷氨酰胺濃度為 2.5 mM，而無血清/無蛋白雜交瘤培養(yǎng)基中的最佳 L-谷氨酰胺濃度為 2.7 mM。對于DMEM、GMEM、IMDM和 H-Y 培養(yǎng)基，最佳濃度為 4 mM。IMDM 通常用作專有雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基的起始配方；在L-谷氨酰胺濃度高于培養(yǎng)基建議平均濃度條件下，雜交瘤細(xì)胞長得更好。

L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的應(yīng)用

鑒于L-谷氨酰胺的化學(xué)不穩(wěn)定性和它對細(xì)胞生長和功能的重要性，有針對性地根據(jù)不同細(xì)胞的培養(yǎng)過程優(yōu)化L-谷氨酰胺添加就顯得尤為關(guān)鍵。谷氨酰胺的分子式為C5H10N2O3，分子量為146.15g/mol，等電點(diǎn)為5.65，pka為2.17和9.13。為了在細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用中有效地使用這種補(bǔ)充劑，需要了解 L-谷氨酰及其替代品的的化學(xué)性質(zhì)及多種遞送形式。

圖 1.L-谷氨酰胺化學(xué)結(jié)構(gòu)。

谷氨酰胺能支持有較高能需，并且合成大量蛋白及核酸的細(xì)胞的成長。它還可作為細(xì)胞快速分裂和無法有效使用葡萄糖類細(xì)胞的另一種能量來源。細(xì)胞需要谷氨酰胺中的氮原子來構(gòu)建一些分子，比如核苷酸，氨基酸，氨基糖和維生素。

谷氨酰胺是谷氨酸前體。谷氨酸是作用于α-酮酸轉(zhuǎn)氨形成其他α氨基酸的關(guān)鍵氨基酸。谷氨酰胺中酰胺和胺各含有一個氮原子；它還可將氮元素大量運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)，同時又沒有游離胺的毒性。

當(dāng)葡萄糖含量低而能量需求高時，細(xì)胞能分解氨基酸獲得能量。谷氨酰胺中酰胺氮被用于維生素NAP和NADP，嘌呤核苷酸，UPT轉(zhuǎn)CTP和天冬酰胺酸的合成。谷氨酰胺中的氮還可以用來生產(chǎn)嘧啶合成所需要的氨甲酰磷酸。谷氨酰胺是最易使用的可以作為能量來源的氨基酸之一。它也是許多體外細(xì)胞快速分裂的主要能量來源。

谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性

當(dāng)谷氨酰胺作為蛋白質(zhì)或者肽類的氨基酸殘基時，它是穩(wěn)定的。這種條件必需氨基酸是含有R基團(tuán)酰胺的易溶中性氨基酸。由于它不穩(wěn)定，在液體培養(yǎng)基中，不需要酶就能夠分解成氨和焦谷氨酸（吡咯烷酮羧酸）。L-谷氨酰胺隨時間分解程度取決于培養(yǎng)基的pH，溫度和各種陰離子。

谷氨酰胺脫氨是一種氨去氨反應(yīng)，可在酸性和堿性條件下發(fā)生。當(dāng)培養(yǎng)基中存在磷酸鹽或碳酸氫鹽時，反應(yīng)速度明顯更快。液體培養(yǎng)基中的磷酸鹽濃度固定時，去氨速率隨著 pH 從 4.3 增加到 10 而遞增。

L-谷氨酰胺生物化學(xué)

生成谷氨酸和谷氨酰胺的固氮反應(yīng)需要消耗能量等價物，例如 NADH、NADPH 或 ATP。谷氨酸是由銨和α-酮戊二酸，一種三羧酸循環(huán)（TCA）中間物合成。這一合成需要NADH 或NADPH的氧化。谷氨酸合成所需要的酶谷氨酸脫氫酶(EC 1.4.1.4)和谷氨酸合成酶(EC 1.4.1.13)是可逆的。

細(xì)胞所用的銨（無機(jī)氮源）首先被加入到有機(jī)氮中，成為谷氨酸中的胺或谷氨酰胺中的酰胺。這兩種氨基酸則可以作為蛋白質(zhì)，核酸和其他含氮化合物合成的主要氮源庫。體內(nèi)產(chǎn)生（而非體外產(chǎn)生）的銨能通過尿素代謝。在某些體外條件下，氨在細(xì)胞外培養(yǎng)基中以銨離子的形式累積。

谷氨酰胺是由氨和谷氨酸分子合成。合成需要消耗ATP形式的能源。此合成所需要的酶，谷氨酰胺合成酶 (EC 6.3.1.2)，受到高度調(diào)控以控制谷氨酰胺的產(chǎn)出量，符合細(xì)胞需求。銨是細(xì)胞使用的無機(jī)氮源，最初以谷氨酸胺的形式摻入有機(jī)氮中。在包被的表面上，可以對貼壁細(xì)胞進(jìn)行固定和染色。