Argonaute促進的靶向是一種酶介導的、高保真的、高效的堿基配對過程，可以重新用于升級PCR技術(shù)。來自嗜熱Caloramator sp.（CalAgo）的Argonaute蛋白在65°C的Tte-UvrD解旋酶存在下切割靶dsDNA，表明dmCalAgo（一種核酸酶失活突變體）在相同條件下與靶dsDNA結(jié)合。

2025年4月22日，杭州微編生物科技有限公司韓春雨、高峰共同通訊在bioRxiv在線發(fā)表題為“Introducing An Argonaute-facilitated Isothermal Amplification Technology”的研究論文，該研究通過dmCalAgo、Tte-UvrD解旋酶和Bst DNA聚合酶的協(xié)同作用設計了一個Argonaute促進的等溫PCR平臺（等溫Ago-PCR）。

等溫Ago-PCR在65°C下實現(xiàn)了模板的擴增。升級在于用Argonaute促進的靶向取代引物退火。因此，等溫Ago-PCR不僅消除了對復雜引物設計和精密儀器的依賴，而且實現(xiàn)了高保真和高效的擴增。該平臺能夠在30分鐘內(nèi)檢測到低拷貝模板（每個反應僅3個拷貝），實現(xiàn)了與qPCR相當?shù)撵`敏度，同時展示了優(yōu)異的擴增動力學。該平臺還展示了與常見熱維護工具的兼容性。因此，等溫Ago-PCR有可能取代qPCR，具有廣泛的適用性。

該研究通過DNA引導的DNA pAgos（包括TtAgo、NgAgo和CbAgo）的比較序列分析，從嗜熱細菌Caloramator sp.ALD01（NCBI序列ID:WP_027308646.1）中篩選出Argonaute蛋白，并將其命名為CalAgo[1,2]。體外切割試驗表明，CalAgo具有DNA引導的內(nèi)切酶活性，而dmCalAgo（一種核酸酶失活突變體）消除了可檢測的內(nèi)切酶能力。此外，研究人員系統(tǒng)地表征了CalAgo的酶學性質(zhì)。就二價金屬陽離子依賴性而言，CalAgo在Mg2?存在下表現(xiàn)出切割活性?, Mn2?, Co2?,或Ca2?,觀察到Mg2?的最佳效率? Mn2?。

等溫Ago-PCR的理論工作模型（圖源自bioRxiv）

在Tte-UvrD解旋酶存在的情況下，CalAgo表現(xiàn)出強大的dsDNA切割活性。這種協(xié)同效應可能源于解旋酶介導的dsDNA解旋到瞬時ssDNA區(qū)域，隨后允許CalAgo/gDNA復合物進行序列特異性結(jié)合和切割。因此，這種協(xié)同效應可以重新用于等溫放大中的退火升級。通過將切割缺陷的dmCalAgo突變體和Tte-UvrD解旋酶與鏈置換DNA聚合酶（如Bst-LF）結(jié)合，提出了一種Argonaute促進的等溫擴增平臺，稱為等溫Ago-PCR。

該研究表明，等溫Ago-PCR平臺對M13mp18模板顯示出強大的擴增效率，凝膠電泳分析中清晰的產(chǎn)物積累證明了這一點。此外，等溫Ago-PCR在環(huán)狀ssDNA、線性dsDNA和質(zhì)粒中也實現(xiàn)了相當?shù)臄U增效率，顯示出廣泛的模板多樣性。對等溫Ago-PCR和常規(guī)qPCR之間的靈敏度和擴增動力學進行的基準分析顯示，前者具有顯著的性能優(yōu)勢。定量評估表明，等溫Ago-PCR的靈敏度（每個反應3個拷貝）與qPCR相當，反應動力學顯著加速。關鍵的是，等溫Ago-PCR僅使用常見的熱維護工具就實現(xiàn)了低拷貝靶標（每個反應<10個拷貝）的靈敏檢測。這些流線型硬件要求將平臺定位為現(xiàn)場可部署的護理點診斷解決方案。

參考信息：

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.04.21.649904v1