抗體藥物偶聯(lián)物( antibody-drug conjugates，ADC) 是一類由單克隆抗體和小分子細胞毒性藥物通過連接子偶聯(lián)而成的新型生物治療藥物。與傳統(tǒng)的細胞毒藥物相比，ADC 具有靶向性強、毒副作用小等優(yōu)勢，在臨床上展現(xiàn)較好的治療潛力。其中，抗體部分通過與腫瘤細胞表面的靶向抗原結合，精準地將小分子細胞毒性藥物遞送至腫瘤部位，從而實現(xiàn)腫瘤特異性殺傷效果，是影響 ADC療效的核心要素之一。截至目前，全球已獲批上市了19款ADC藥物。

直播預告：今晚8點00分，小藥說藥直播間和大家聊一聊抗體偶聯(lián)藥物：ADC概論，歡迎大家關注小藥說藥視頻號，預約報名！

ADC理想的抗體

1.較高的內(nèi)化效率

抗原抗體復合物的內(nèi)化效率主要取決于抗體與腫瘤細胞表面抗原之間的結合親和力，較高的親和力通常會導致更快速的內(nèi)化。而具有高抗原親和力的抗體可能反過來減少實體瘤的滲透。實體瘤的治療因存在“結合位點屏障”比血瘤更為復雜，抗體和抗原之間極強的結合導致ADC在外滲后易在血管附近被捕獲，但從血管到靶向腫瘤細胞的滲透較少。因此，應優(yōu)化抗原和抗體之間的親和力，平衡靶細胞中的快速吸收和抗癌效力。

2.低免疫原性

免疫原性主要和抗體來源相關。在ADC藥物開發(fā)早期，主要使用小鼠來源的抗體，由于嚴重的免疫原性相關副作用，易引起急性超敏反應或產(chǎn)生人抗鼠中和性抗藥抗體，研發(fā)失敗率較高。隨著重組技術的出現(xiàn)，小鼠抗體大多被嵌合抗體和人源化抗體所取代，免疫原性顯著降低。

3.較長的血漿半衰期

理想的抗體應具有較長的血漿半衰期，保證ADC藥物足夠長的時間到達目標腫瘤細胞發(fā)揮作用。

截至目前，全球已獲批上市了19款ADC藥物，其中僅有兩款ADC采用IgG4亞型，其他均為IgG1亞型。

抗體結構

抗體是存在于B細胞表面或者由漿細胞分泌的能夠結合抗原的免疫球蛋白。抗體包括膜結合型（mIg）和分泌型（sIg）兩種形式。膜結合型抗體存在于B細胞表面，比如單體的IgM。分泌型抗體是由漿細胞分泌到體液中，介導體液免疫應答的。

抗體由兩條重鏈(Heavy chain，H鏈)和兩條輕鏈(Light chain，L鏈)組成(重鏈和輕鏈是根據(jù)他們分子量大小來命名的，其相對分子質(zhì)量分別約為 50-75 kDa 和 25 kDa)，重鏈之間及重鏈和輕鏈之間由二硫鍵連接，形成的四聚體構象與英文大寫字母“Y”類似。

不同免疫球蛋白重鏈和輕鏈的氨基酸序列上，其氨基端(N端)約110個氨基酸序列變化很大，稱為可變區(qū)(variable region，V區(qū))，而羧基末端(C端)則相對穩(wěn)定，變化很小，稱為恒定區(qū)(constant region，C區(qū))。重鏈和輕鏈可變區(qū)（VH和VL）各有3個區(qū)域的氨基酸組成和序列高度可變，稱為互補決定區(qū)（complementarity determining region, CDR），分別為CDR1、CDR2和CDR3，CDR以外區(qū)域的氨基酸組成和排列順序相對不易變化，稱為骨架區(qū)（framework region, FR），分別為FR1、FR2、FR3和FR4。正是VH和VL的3個CDR在空間上形成了特定構象，從而識別和結合抗原，發(fā)揮免疫效應。CDR區(qū)的氨基酸序列和空間結構決定了抗體識別抗原的多樣性和特異性。

輕鏈（Light chain）由214個氨基酸殘基組成，通常不含碳水化合物，有兩個結構域（由可變區(qū)（V-region）和恒定區(qū)（C-region）組成，所以取字母縮寫就分別叫VL和CL。輕鏈可分為kappa（κ）與lambda（λ）兩個亞型，在不同的免疫球蛋白分子中，輕鏈的類型不同是常見的，但在同一免疫球蛋白分子中，兩條輕鏈都是相同類型的。κ和λ亞型的比例因物種而異，如在老鼠中大約有95%的κ型輕鏈和5%的λ型輕鏈，而在人類中這一比例分別為60%和40%。

重鏈（Heavy chain）由450~550個氨基酸殘基組成，含糖數(shù)量不同，也是由可變區(qū)和恒定區(qū)組成，所以取字母縮寫就分別叫VH、CH1、CH2和CH3?？贵w重鏈恒定區(qū)CH1和CH2之間存在鉸鏈區(qū)，該區(qū)域含有木瓜蛋白酶和胃蛋白酶水解位點，可以將抗體水解為Fab、F(ab')2和Fc片段。Fab段為抗原結合片段（fragment of antigen binding，F(xiàn)ab），由一個完整的輕鏈和重鏈的VH和CH1結構域組成。Fc段為可結晶段（fragment crystallizable，F(xiàn)c），相當于Ig的CH2和CH3結構域，是Ig與效應分子或者細胞相互作用的部位：CH2涉及補體結合位點激活補體途徑，CH3區(qū)域涉及到細胞膜表面受體結合，從而觸發(fā)抗體介導的宿主效應功能（effector function)，CH2-N297號氨基酸位點糖基化修飾也會影響其受體結合及效應，同時恒定區(qū)也是應用熒光素、同位素、酶等標記抗體的重要基礎。

抗體種類

根據(jù)重鏈恒定區(qū)的結構差異，可分為γ、μ、α、δ、ε鏈，它們分別與輕鏈（κ或λ）組成完整的免疫球蛋白分子，對應5類抗體：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE。

IgA與IgM作為二聚體與五聚體的免疫球蛋白，分子量大，滲透能力弱，又因為IgD具有循環(huán)不穩(wěn)定性以及IgE在人體內(nèi)分布稀少，只有IgG兼顧有適中的分子量和數(shù)量，這使其具有一定的腫瘤滲透能力，又具有較長的半衰期，保證了其在體循環(huán)中的穩(wěn)定。因此，一般選用 IgG 作為構建 ADC 藥物的抗體。IgG是血清中最主要的免疫球蛋白，含量占總免疫球蛋白的65-75%左右。IgG具有抗病毒、中和病毒、抗菌及免疫調(diào)節(jié)的功能，也是唯一能夠通過胎盤的抗體，在新生兒抗感染中起重要作用。在免疫檢測中，幾乎只用IgG，它具有眾多優(yōu)點：1.在免疫反應中產(chǎn)量最高；2.與抗原表位的結合親和力最強；3.在分離純化過程中穩(wěn)定；4.研究透徹，已累計豐富改造經(jīng)驗。

IgG抗體不同亞型

IgG可進一步分為四個亞類，按豐度遞減的順序命名為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。這四個亞型的比例分別為60%、32%、4%和4%。IgG的亞型是在20世紀60年代使用抗人IgG骨髓瘤蛋白的特異性兔抗血清進行廣泛研究后發(fā)現(xiàn)的。雖然它們在氨基酸水平上超過90%相同，但每個亞型在抗原結合、免疫復合物形成、補體激活、效應細胞觸發(fā)、半衰期和胎盤轉(zhuǎn)運等方面具有明顯差異。IgG1的Fc段與FcγR的結合能力最強，IgG1半衰期更長和誘導 ADCC 和 CDC 更有效。IgG2通過非共價關聯(lián)和高溫在體內(nèi)形成二聚體，由于空間位阻而顯示出較低的效力。IgG3的半衰期非常短，約為7天，因此降低了治療效果，很少被考慮用作抗腫瘤抗體的藥物。盡管IgG4具有誘導ADCC的能力，但它含有Fab-arm交換，導致有效性降低。

IgG分子的二硫鍵結構

經(jīng)典二硫鍵結構

IgG的四個亞類的二硫鍵結構在20世紀60年代建立。這些二硫鍵結構被稱為經(jīng)典的二硫鍵結構，因為它們被廣泛接受。如圖所示，IgG抗體的四個亞型IgG1、IgG2、IgG3、Ig4G的二硫鍵結構存在許多相似性和一些差異。

鏈內(nèi)二硫鍵：IgG1, IgG2, IgG3和IgG4都含有12對鏈內(nèi)二硫鍵。

鏈間二硫鍵：鏈間二硫鍵參與重鏈-重鏈和重鏈-輕鏈的連接。對于鉸鏈區(qū)重鏈-重鏈的連接，IgG1, IgG2, IgG3和IgG4中分別有2, 4, 11和2對二硫鍵；對于重鏈-輕鏈的連接，IgG1中輕鏈的最后一個半胱氨酸殘基與重鏈的第五個半胱氨酸殘基連接，IgG2, IgG3和IgG4中則是輕鏈的最后一個半胱氨酸殘基與重鏈的第三個半胱氨酸殘基連接。

溶劑暴露程度：鏈內(nèi)二硫鍵和鏈間二硫鍵的溶劑暴露程度不同。鏈內(nèi)二硫鍵被埋藏在每個結構域內(nèi)兩層反平行的β-Sheet結構之間，并且不暴露在溶劑中；鏈間二硫鍵位于鉸鏈區(qū)，高度暴露于溶劑中。溶劑暴露的差異具有重要意義，因為暴露的半胱氨酸殘基被認為比未暴露的半胱氨酸殘基更具活性。

非典型的二硫鍵連接方式

主要在IgG2和IgG4中觀察到了非典型的二硫鍵變體 (IgG1只觀察到微量變體，兩個重鏈間二硫鍵以鏈內(nèi)形式存在；而IgG3鉸鏈區(qū)重復氨基酸序列形成11對二硫鍵，這使得其并不容易出現(xiàn)二硫鍵變體)。

IgG2的二硫鍵變體：IgG2的二硫鍵變體與其輕鏈的類型有關。IgG2的主要形態(tài)為IgG2A型，其輕鏈類型為λ輕鏈，而輕鏈為κ輕鏈的稱為IgG2B型 (如圖所示重鏈第三個半胱氨酸與鉸鏈區(qū)半胱氨酸相連，而鉸鏈區(qū)一對半胱氨酸與相應輕鏈最后一個半胱氨酸相連)。IgG2A/B認為是一種IgG1A和IgG2B之間的中間體。分子動力學模擬表明，鏈間二硫鍵上的硫原子具有很強的活動性，可以緊密靠近，這也解釋了為什么多種形態(tài)的IgG2可以共存，在細胞培養(yǎng)和體外血清培養(yǎng)中都觀察到IgG2A向IgG2B型的轉(zhuǎn)變。研究表明典型二硫鍵形態(tài)的IgG2A比IgG2B有更高的結合親和力和生物學活性。

IgG4的二硫鍵變體：IgG4是最著名的具有非經(jīng)典二硫鍵結構的IgG亞型。主要基于以下幾點觀察：其一是發(fā)現(xiàn)SDS-PAGE中觀察到IgG4的半抗結構，而SEC中卻檢測不到，表明兩個半抗間通過非共價相互作用連接，而不是經(jīng)典結構中的二硫鍵；其二是多克隆的IgG4不能交聯(lián)抗原，其行為類似于單價抗體，而單克隆的IgG4可以交聯(lián)抗原；其三是作為理論上共價連接單體的IgG4在血漿中表現(xiàn)出雙特異性。這些觀察結果表明，IgG4的兩個重鏈間二硫鍵會轉(zhuǎn)變?yōu)殒渻?nèi)二硫鍵形式，并且兩種形式會保持平衡。野生型IgG4結構比較獨特，IgG4鉸鏈區(qū)含有CPSC序列，會形成鏈內(nèi)重-重二硫鍵（Intra-HH），將CPSC序列改造成CPPC或其它突變體，以改善鏈內(nèi)HH二硫鍵問題。

IgG1與IgG4的鏈間二硫鍵還原途徑差異及其分子機制

在mAb的生產(chǎn)過程中，以蛋白A色譜從細胞培養(yǎng)液（HCCF）中捕獲和純化抗體，再檢測各個步驟樣品中的LMW種類和比例。在這些樣品中，可以檢測到不同種類的LMW，其中大部分為半抗體（HL）和缺失一條輕鏈的mAb（HHL）。而且，IgG1和IgG4的LMW形式不盡相同：IgG1樣品中的LMW主要為HHL，而IgG4樣品中的LMW主要為HL。

由此推測，二者LMW形成途徑可能不一樣。在一種途徑中，H鏈間的二硫鍵（HH）首先斷裂，先形成兩個半抗體（HL），重-輕鏈之間的二硫鍵的進一步斷裂后形成單獨的H鏈和L鏈，即所謂HL途徑。另一種途徑中，重-輕鏈之間的二硫鍵首先斷裂形成HHL和L，HHL再被進一步還原為HH，最后H鏈間的二硫鍵被還原形成兩條H鏈，即所謂HHL途徑。

Song Y等研究者還使用兩種工程化的模型分子mAb1 (IgG1) 和 mAb2 (IgG4)進一步證明了這一推測。采用不同量的還原劑三（2-羧乙基）膦（TCEP）、2-巰基乙醇（β-ME）和二硫蘇糖醇（DTT）處理這兩種分子，然后再采用基于微芯片的毛細管電泳方法進行LMW分析。結果表明mAb1和mAb2遵循不同的LMW形成途徑。mAb1 主要遵循 HHL 途徑。隨著還原劑TCEP濃度從0mM逐漸增加到10mM，HHL隨著TCEP濃度從0mM增加到4mM而逐漸增加。HH作為6 mM TCEP 的中間體出現(xiàn)。mAb1在≥8 mM TCEP 時完全還原為H和L。HL 中間體幾乎不出現(xiàn)在 mAb1 LMW 形成中。相比之下，mAb2 主要遵循 HL 途徑。在 2 mM TCEP 下，mAb2 幾乎沒有還原。隨著 TCEP 增加到 4 mM，mAb2 開始形成 HHL、HL 和 L 作為主要種類。從 6 到 10 mM，HHL 逐漸減少，HL 逐漸增加。正如預期的那樣，H 和 L 也在增加。然而，在增加TCEP 的同時，HH 水平仍然很低。以HL為特征物種且?guī)缀鯖]有HH物種的mAb2的LMW模式表明 mAb2 主要遵循HL途徑。

另外，還觀察到在最高研究的 TCEP濃度 (10 mM) 下，mAb1 完全還原為H和L，而mAb2 僅部分還原為H和L（H和L積分之和僅占 28%）。這一系列證據(jù)表明，mAb1比mAb2對還原劑TCEP更敏感。

MD 模擬軌跡中 IgG1 中 HL 間二硫鍵的溶劑可評估表面積顯著高于 IgG4 中的溶劑可評估表面積

IgG1的 HL間二硫鍵的溶劑可及性面積大于其HH間二硫鍵，故HL間二硫鍵比HH間的二硫鍵更易受影響?；谶@個機制，IgG1主要通過HHL途徑發(fā)生還原，首先被還原為HHL，隨著環(huán)境還原性增強，HHL再進一步被還原為HH。

IgG4中HH間二硫鍵的溶劑可及性高于HL間二硫鍵，故HH間二硫鍵比HL間的二硫鍵更易受影響?；谶@個機制，IgG4主要通過HL途徑發(fā)生還原，首先被還原為HL，隨著環(huán)境還原性增強，HL再進一步被還原為H。故HH間二硫鍵隨著環(huán)境還原性變強而被快速還原，產(chǎn)生HL；當還原性達到一定強度時，HL間二硫鏈也會被還原，從而產(chǎn)生HL和HHL共存，但HL居多。這是因為在野生型IgG4中幾乎沒有HHL，這表明其HH間二硫鍵和HL間二硫鍵對還原性環(huán)境的敏感性明顯不同。這可能是由于野生型IgG4中鉸鏈區(qū)為CPSC序列，而工程化的IgG4中為CPPC。與CPPC相比，CPSC的柔性更高，故其溶劑可及性面積也更大，所以野生型IgG4僅通過HL途徑發(fā)生還原。通過S228P突變可以顯著穩(wěn)定IgG4重鏈之間的二硫鍵作用，因此已廣泛用于IgG4抗體的開發(fā)和生產(chǎn)。而且，S228P突變在IgG4鉸鏈中形成多脯氨酸螺旋（PPCPPCP），配合較短的鉸鏈長度，與IgG1鉸鏈（HTCPPCP）相比進一步限制了其柔性。有實驗表明，S228P 突變IgG4的重輕鏈間二硫鍵和重重鏈間二硫鍵均為弱反應性。

基于IgG1與IgG4鏈間二硫鍵反應性存在差異，藥明生物通過抗體鉸鏈區(qū)工程化改造（專利號CN114127117A）改善了生物偶聯(lián)物的藥物抗體比率（DAR）。例如將IgG1的鉸鏈區(qū)（或其部分）與IgG4的Fab結構域C端相接，改變了鏈間二硫鍵反應性，引導優(yōu)先還原并偶聯(lián)重鏈之間的二硫鍵；將IgG4的鉸鏈區(qū)（或其部分）與IgG1的Fab結構域C端相接，改變了鏈間二硫鍵反應性，引導優(yōu)先還原并偶聯(lián)重鏈與輕鏈之間的二硫鍵。

天然IgG1與IgG4

IgG4的Fab片段+IgG1的鉸鏈區(qū)

IgG1的Fab片段+IgG4的鉸鏈區(qū)

不同IgG亞型對ADC藥物的影響

目前全球上市的19款ADC，有13款利用抗體鏈間半胱氨酸偶聯(lián)技術。在眾多抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）臨床候選物中，最常見的一種也是利用抗體鏈間半胱氨酸偶聯(lián)技術。由于不同亞型IgG在鏈間二硫鍵結構以及鏈間二硫鍵還原機制等方面存在差異，因此不同IgG亞類影響ADC分子的生物物理性質(zhì)和體內(nèi)藥代動力學（PK）等。

Datta-Mannan等人使用三種人源抗體mAbH1（IgG1）、mAbH2（IgG2）和mAbH4（IgG4 S228P/F234A/L235A）（具有相同可變區(qū)）組成的模型系統(tǒng)，利用鏈間半胱氨酸偶聯(lián)技術，與Mal-cy-vcMMAE偶聯(lián)，所得ADC分別命名為mAbH1-ADC、mAbH2-ADC和mAbH4-ADC。在平均DAR數(shù)相似的情況下，通過HIC和LC-MS表征每個ADC中的藥物偶聯(lián)特征。

疏水色譜（HIC）的藥物偶聯(lián)分析顯示，mAbH2-ADC的HIC圖譜比mAbH1-ADC、mAbH4-ADC更復雜，這是由于其鉸鏈區(qū)有4對鏈間二硫鍵，比mAbH1-ADC、mAbH4-ADC多2對二硫鍵。另外有趣的是，在mAbH4- ADC中，DAR 6組分遠比mAbH1-ADC和mAbH2- ADC中相應的DAR 6組分更疏水。

液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）的藥物偶聯(lián)分析顯示，在IgG1抗體中，有50%的重輕鏈間二硫鍵被還原且偶聯(lián)藥物，而在IgG2抗體中僅為10%，在IgG4抗體中為20%。

SDS-PAGE凝膠顯示mAbH4-ADC中存在大量HL組分，而該組分在mAbH1-ADC中不太突出，在mAbH2-ADC中可忽略不計。非還原性SDS-PAGE凝膠也證實mAbH1和mAbH4還原途徑是不一致的。

通過濃縮實驗和擴散相互作用參數(shù)測量，我們發(fā)現(xiàn)藥物偶聯(lián)對這三種抗體的行為產(chǎn)生了不同的影響，其中基于IgG2的ADC具有最強的聚集傾向。通過動態(tài)光散射（DLS）測量擴散相互作用參數(shù)kD。該參數(shù)反映了溶液中分子之間的吸引或排斥，正的kD值指示強的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)排斥相互作用，而高度負的kD值指示吸引相互作用，從而指示在非常高的濃度下形成聚集體的趨勢。所有三種抗體的kD值均為顯著負值，表明在此條件下具有吸引力的分子相互作用。在這三種抗體中，mAbH4具有比mAbH1和mAbH2更小的負kD，表明mAbH4在該條件下比其他兩種抗體更不易于聚集。偶聯(lián)Mal-cy-vcMMAE的后導致所有三種抗體的kD顯著降低，不同的IgG亞型降低的幅度不同，表明藥物偶聯(lián)后對三種抗體的膠體穩(wěn)定性影響不同。mAbH1與mAbH1-ADC相比，kD值降低了6.8mL/g。mAbH4與mAbH4-ADC相比，kD值降低了12.4mL/g。mAbH2和mAbH2-ADC之間下降幅度最大，kD值降低了17.5mL/g。結果顯示三種ADC之間的穩(wěn)定性與濃縮實驗期間的觀察結果一致，其中mAbH2-ADC在濃縮時顯示聚集增加最多。

使用基于LC-MS的生物分析方法進行的大鼠PK研究表明，基于IgG1的ADC具有較差的外周連接子-有效載荷穩(wěn)定性，而基于IgG2和IgG4的ADC則表現(xiàn)出穩(wěn)定性?；贗gG2的ADC的偶聯(lián)物穩(wěn)定性在食蟹猴PK研究中得到進一步證實?？傮w而言，基于IgG2的ADC表現(xiàn)出最佳的PK/偶聯(lián)物穩(wěn)定性。

體外血漿穩(wěn)定性結果顯示，三種mAb偶聯(lián)后ADC隨時間含量減少，其穩(wěn)定性順序如下：mAbH 2- ADC > mAbH 4-ADC > mAbH 1-ADC。

ADC藥物抗體IgG亞型的選擇

目前全球上市的19款ADC，其中僅有兩款ADC采用IgG4亞型抗體，其他均為IgG1亞型抗體。

抗體的作用機制影響著它的臨床應用及開發(fā)潛能，為達到期望的治療效果并且避免不良反應，在開發(fā)前首先考慮抗體亞型的選擇顯得越來越重要。在選擇IgG亞型時，首先要考慮不同IgG亞型的分子結構、穩(wěn)定型以及體內(nèi)藥代動力學等。除此之外還需考慮腫瘤靶點的類型以及由抗體 Fc 段效應產(chǎn)生的影響，如一些靶點在腫瘤細胞中獨有或特異性高的情況，選擇 IgG1 作為 ADC 藥物的載體可以提高免疫效應，若靶點并非腫瘤細胞特有，則為了減少 ADCC /CDC可能帶來的毒副作用，需要優(yōu)先考慮 IgG2 或 IgG4 作為 ADC 藥物的載體。

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