文/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳昌福，武漢科研時代生物技術(shù)有限公司 周鑫軍

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陳昌福有話說

致病性細菌耐藥性問題，與21世紀(jì)人類健康的密切相關(guān)性已經(jīng)逐漸成為世界各國科學(xué)家的共識。世界衛(wèi)生組織以及我國等多個國家，為了遏制細菌耐藥性蔓延而制定了相應(yīng)的行動計劃。

為了響應(yīng)我國國家衛(wèi)生健康委等多個部門聯(lián)合制定的《遏制細菌耐藥國家行動計劃（2016-2020年）》和《遏制微生物耐藥國家行動計劃（2022~2025）》，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也數(shù)次頒布了《全國遏制動物源細菌耐藥行動計劃》。

雖然我國正在強調(diào)無抗養(yǎng)殖等，但是，迄今為止，采用水產(chǎn)用抗微生物獸藥，治療水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的細菌性疾病，依然是國內(nèi)外控制水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細菌性疾病最有效的治療方法。而在采用水產(chǎn)用抗微生物藥物治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病之前，完成從患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)獲得分離菌株，并且對分離致病性菌株完成藥物敏感性實驗，是確保實現(xiàn)科學(xué)、精準(zhǔn)、高效治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的前提。

本文指出了在我國部分水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)域的水產(chǎn)服務(wù)人員，在完成從患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)獲得的分離菌株的藥物敏感性實驗時，采用的藥敏實驗方法是相對簡單紙片法或者牛津杯法，獲得檢測結(jié)果雖然可以證明供試藥物是否具有抑、殺菌功效，但是，用這種定性的方法的獲得的檢測結(jié)果，是不能用于精準(zhǔn)確定治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物用藥劑量的。這是實現(xiàn)科學(xué)、精準(zhǔn)、高效使用水產(chǎn)用抗微生物獸藥中需要改進的藥敏實驗方法內(nèi)容。

抗微生物藥物敏感性檢測方法

及其對科學(xué)用藥的重要性

摘要：本文針對水產(chǎn)養(yǎng)殖中介紹了對抗微生物藥物進行藥敏試驗檢測的重要意義及其用藥劑量計算方法。旨在為科學(xué)地使用抗微生物藥物、避免和減少致病性微生物對抗微生物藥物產(chǎn)生耐藥性。文章中對幾種檢測致病性微生物，對抗微生物藥物敏感性的檢測方法，進行了重點介紹，指出常用的紙片擴散法（K-B法）和牛津杯法只能用于抗微生物藥物定性，而僅依靠K-B法獲得的抗微生物藥物敏感性檢測結(jié)果，是難以用于實際治療疾病時用藥量計算的。抗微生物藥物用藥量的計算，需要依靠用試管內(nèi)系列濃度稀釋法，檢測抗微生物藥物對致病性微生物的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

關(guān)鍵詞：抗微生物藥物；藥物敏感性試驗；最小抑菌濃度；精準(zhǔn)用藥；用藥系數(shù)

最近幾年來，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的人們均可以明顯地感受到，對由各種致病性細菌引起的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物傳染性疾病，要實施有效的藥物治療已經(jīng)變得越來越困難了。人們對于導(dǎo)致水產(chǎn)用獸藥治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物沒有療效的原因，先后已經(jīng)列出了各種各樣的推測：首先，有人認(rèn)為是由于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物因近親繁殖等導(dǎo)致了水產(chǎn)養(yǎng)殖動物種質(zhì)退化，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中對養(yǎng)殖水體中常在的致病性細菌等的免疫抵抗力下降了，更容易感染各種致病性細菌了；其次，在單位面積水體中放養(yǎng)的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物苗種數(shù)量大幅度增加，因為高密度形成的擁擠因子（crowding factor）等，對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物產(chǎn)生的環(huán)境應(yīng)激性刺激，致使水產(chǎn)養(yǎng)殖動物自身免疫系統(tǒng)的免疫防御功能遭受到抑制，對養(yǎng)殖水體中常在的致病性生物的易感性增加，導(dǎo)致了各種傳染性疾病的多發(fā)；其三，因為近些年來不斷地推廣實施高密度、集約化的水產(chǎn)養(yǎng)殖方式，養(yǎng)殖水體中因為水產(chǎn)養(yǎng)殖動物未攝食的殘餌與排泄的大量糞尿等，造成養(yǎng)殖水體中有機物大量積累引起養(yǎng)殖水體中的水質(zhì)惡化，直接危及到水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的健康等。這些因素都是能導(dǎo)致水產(chǎn)用獸藥難以有效治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的重要原因。

在我國以往的水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，有一個常見的使用水產(chǎn)用獸藥的方法，是直接導(dǎo)致當(dāng)前水產(chǎn)用獸藥難以有效治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的重要原因。這就是因為大多數(shù)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者采用水產(chǎn)用獸藥治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物前，并沒有做到清楚了解致病性生物對水產(chǎn)用獸藥的敏感性及其敏感程度，不能做到選擇適宜的水產(chǎn)用獸藥做到精準(zhǔn)用藥治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的緣故。而是在采用水產(chǎn)用獸藥治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病時，幾乎都是在盲目、輪流地使用一些水產(chǎn)用獸藥。盲目、濫用水產(chǎn)用獸藥的結(jié)果，就是導(dǎo)致致病性生物對水產(chǎn)用獸藥產(chǎn)生越來越嚴(yán)重的耐藥性（drug resistance），長此以往水產(chǎn)用獸藥在治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中也就失去了應(yīng)有的治療效果。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中濫用水產(chǎn)用抗微生物獸藥防控水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的細菌性疾病，無疑是對于遏制細菌耐藥性快速蔓延不利的。多年來，我們一直提倡在防治水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病過程中，需要檢測致病性生物對水產(chǎn)用獸藥敏感性的基礎(chǔ)上，進行科學(xué)選擇和精準(zhǔn)使用水產(chǎn)用獸藥。現(xiàn)在，已經(jīng)有一些水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者開始行動起來，從患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)分離致病性生物，在完成對致病性生物的藥物敏感性檢測后，選擇適宜的水產(chǎn)用獸藥治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物。毫無疑問，這是科學(xué)診治患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物良好開端，是值得肯定、鼓勵的方向與行動。

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幾種常用的藥敏試驗檢測方法

利用從患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物體內(nèi)獲得的分離菌株，在離體條件下完成水產(chǎn)用抗微生物藥物對分離菌株的藥物敏感性試驗，簡稱藥敏試驗（Antimicrobial Sensitivity Test，AST）。藥敏試驗是指供試藥物抑制或殺滅分離菌株能力的試驗。根據(jù)藥敏試驗的目的，常用的藥敏試驗檢測方法有紙片擴散法、液體培養(yǎng)基稀釋法、瓊脂板稀釋法、E-test法和自動化儀器法等，本文根據(jù)我國水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)域的一些實驗室采用的藥敏試驗方法，提出部分建議。

1.1紙片擴散法

藥敏試驗紙片法（disk diffusion method），又稱Kirby-Bauer法，簡稱K-B法。是一種常用的抗微生物藥物敏感性測試方法，用于評估細菌對抗微生物藥物的敏感性，屬于定性試驗方法。紙片擴散法藥敏試驗的原理是，將含有定量的抗微生物藥物的紙片貼在接種有待測菌的固體培養(yǎng)基上，通過抗微生物藥物物在培養(yǎng)基上的擴散，觀察是否出現(xiàn)抑菌環(huán)，推斷是否抑制供試細菌的生長。藥物擴散的距離越遠，藥物濃度越低抑菌能力越強，因此可根據(jù)抑菌環(huán)的大小，判定藥物對致病性微生物的抑制作用強弱。

該方法是將含有定量抗微生物藥物的濾紙片（藥敏片），貼在已接種了待測試的致病性微生物的瓊脂表面上，藥敏片中所含的藥物在瓊脂中擴散，隨著擴散距離的增加，抗微生物藥物的濃度呈對數(shù)減少，在紙片的周圍形成藥物濃度梯度。導(dǎo)致藥敏片周圍能抑菌的藥物濃度范圍內(nèi)的致病性微生物就不能生長，而處于抑菌范圍外的致病性微生物則可以生長，因此，在藥敏片周圍形成透明的抑菌圈（圖1）。不同抑菌藥物的抑菌圈直徑因受藥物在瓊脂中擴

圖1 藥敏試驗中的紙片法抑菌實驗情景

散速度的影響而可能有所不同，抑菌圈的大小即可以反映測試致病性細菌對藥物的敏感程度（表1），并與該藥物對測試致病性微生物的MIC呈負相關(guān)。

表1藥物敏感試驗結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

注意：（1）具體對于不同的致病性微生物菌株，不同的抗微生物藥物紙片需參照NCCLs的標(biāo)準(zhǔn)或者CLSI標(biāo)準(zhǔn)。（2）藥物敏感實驗判定標(biāo)準(zhǔn)參考表1，多黏菌素抑菌圈；在9mm以上為高敏，6~9mm為低敏，無抑菌圈為不敏。

1.2牛津杯法

藥敏試驗牛津杯法（Oxford cup method），是一種用于測定抗微生物藥物或其他抑菌物質(zhì)活性的實驗方法。用于評估細菌對抗微生物藥物的敏感性，與紙片法一樣，也是屬于定性試驗方法。牛津杯法藥敏試驗的原理是，將經(jīng)過高壓消毒潔凈牛津杯（不銹鋼小管，通常高約10mm，直徑約6mm）置放于含有一定濃度的抗微生物藥物定量添加在的固體培養(yǎng)基上，通過添加在牛津杯小管中的抗微生物藥物物在培養(yǎng)基上的擴散，觀察是否出現(xiàn)抑菌環(huán)，推斷是否抑制供試細菌的生長（圖2）。藥物擴散的距離越遠，藥物濃度越低抑菌能力越強，因此可根據(jù)抑菌環(huán)的大小，判定藥物對致病性微生物的抑制作用強弱。

圖2牛津杯法的定性藥物敏感性實驗情景

1.3液體培養(yǎng)基稀釋法

液體培養(yǎng)基稀釋法（broth dilution method）是另一種常用抗微生物藥物敏感性測試方法，屬于能定量的藥物敏感性測定方法。具體的實驗方法就是將抗菌藥物系列稀釋后，與定量供試菌液共孵育一定時間后，觀察供試抗菌藥物對供試致病性菌株的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

該方法根據(jù)培養(yǎng)基容器規(guī)格也分為宏量（試管法，圖3）和微量（微孔板法，圖4）兩種。無論是宏量試管法還是微孔板法，根據(jù)將供試抗菌藥物在液體培養(yǎng)基中的含量，制備成2倍比稀釋抗微生物藥物（如200.0、100.0、50.0、25.0、12.5、6.25……mg/L）。最后，在制備好含有系列藥物濃度的定量培養(yǎng)中，添加定量的供試菌液。恒溫培養(yǎng)一段時間后，觀察藥物對供試致病性細菌的MIC。

液體培養(yǎng)基稀釋法的特點是做到了定量檢測，具有檢測結(jié)果準(zhǔn)確，但是操作比較繁瑣，消耗時間較長等。

圖3液體培養(yǎng)基試管稀釋法檢測致病性細菌的最小抑菌濃度（MIC）

圖4液體培養(yǎng)基微孔板稀釋法檢測致病性細菌的最小抑菌濃度（MIC）

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如何利用藥敏實驗結(jié)果指導(dǎo)用水產(chǎn)用獸藥治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物

2.1要正確利用藥敏實驗方法與結(jié)果

譬如本文中介紹的紙片擴散法和牛津杯法，是屬于利用藥敏實驗為供試藥物定性的方法。其方法獲得的檢測結(jié)果只能說明供試藥物是否具有抑制或者殺滅致病性生物的功能，譬如供試藥物是采用的水產(chǎn)用抗微生物獸藥的話，藥敏實驗結(jié)果只能說明這種供試水產(chǎn)用抗微生物藥物是否還具有抑、殺菌效果。但是，并不能確定使用該藥物劑量能有效地治療水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的細菌性疾病。因此，采用紙片擴散法和牛津杯法完成的藥物敏感性實驗，是不能根據(jù)這種藥物敏感性實驗方法獲得的測定結(jié)果，獲得精準(zhǔn)用藥的治療疾病藥物劑量的。

2.2水產(chǎn)用抗微生物藥物對不同患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的用藥系數(shù)

日本學(xué)者采用日清制藥公司生產(chǎn)的水產(chǎn)用醫(yī)藥品，在完成一系列藥物敏感性實驗研究后，確定了對日本養(yǎng)殖的幾種魚類的抗微生物藥物的用藥系數(shù)（coefficient of administration）。譬如以錦鯉（

Cyprinus carpio

2.3環(huán)境因素對水產(chǎn)用抗微生物藥物治療患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的影響

水產(chǎn)用獸藥對患病水產(chǎn)養(yǎng)殖動物治療疾病的效果，會或多或少地受到水體環(huán)境和給藥方式等因素的影響。如養(yǎng)殖水體的水溫和pH等均會影響到水產(chǎn)用獸藥的用藥效果。當(dāng)人們對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物口服給藥時，還會受到作為水產(chǎn)用獸藥載體的魚用飼料的理化特性等因素的影響。

為了觀察飼料顆粒大小、養(yǎng)殖水體pH和水溫等因素對飼料中藥物溶出速率的影響，F(xiàn)ribourgh等將鹽酸土霉素添加在飼料中，使鹽酸土霉素在飼料中的含量達到1.83 mg/g，制作成兩種不同規(guī)格的圓柱形顆粒飼料，分別將其稱為A與B型顆粒飼料。將這兩種飼料投入到具有不同pH和水溫的水體中以后，測定了兩種不同規(guī)格藥物飼料中的鹽酸土霉素的溶出速度。

試驗方法是分別用紗布將上述兩種藥物飼料包裝后，沉放在1500.0 mL蒸餾水中，在經(jīng)過3、9、15min，取出飼料包裝袋并通過測定蒸餾水中的抗微生物藥物含量，推定藥物從顆粒飼料中的溶出狀況。結(jié)果見表2。從表2中所列測定結(jié)果可以看出，水體的水溫與pH均可以影響A和B型飼料中鹽酸土霉素溶出的時間和速度。

表2鹽酸土霉素從不同直徑顆粒飼料中

的溶出速度比較（Fribourgh等，1969）

* 因為鹽酸土霉素是通過圓柱形顆粒飼料表面溶出的，將圓柱形飼料的半徑以“r”代表，長度以“h”代表，表面積/容積比就可以下式計算。

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作者：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳昌福；武漢科研時代生物技術(shù)有限公司周鑫軍。

編輯：鄭燕云

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