本期推薦的是由上海中醫(yī)藥大學(xué)龍華醫(yī)院急診科、上海中醫(yī)藥大學(xué)急危重癥研究所、浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科、浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室、天津中醫(yī)藥大學(xué)等研究團(tuán)隊(duì)合作近期發(fā)表于Journal of ethnopharmacology(IF5.4）的一篇文章，多組學(xué)揭示復(fù)元醒腦湯通過(guò)腸道菌群和JAK2 - STAT3通路治療腦梗死的作用機(jī)制。

【期刊簡(jiǎn)介】

【題目及作者信息】

Multi-omics Reveals Fuyuan Xingnao Decoction's Therapeutic Mechanism in Cerebral Infararction via Gut Microbiota and JAK2-STAT3 Pathway

民族藥理學(xué)相關(guān)性

腦梗死是一種腦血管疾病，其特征是血管閉塞導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性壞死，繼而引發(fā)神經(jīng)功能缺損。復(fù)元醒腦湯（FYXN）是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院傳統(tǒng)用于防治腦梗死的方劑，但其對(duì)大腦的靶向干預(yù)機(jī)制尚未完全闡明。

目的

本研究旨在探討FYXN對(duì)缺血性腦卒中的治療作用及其潛在機(jī)制，重點(diǎn)分析其對(duì)JAK2-STAT3信號(hào)通路的調(diào)控作用及對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響。

方法

本研究采用代謝組學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，探索FYXN治療缺血性腦梗死的有效成分、潛在靶點(diǎn)和通路。通過(guò)16S rRNA測(cè)序分析缺血性腦梗死大鼠腸道菌群，并定量短鏈脂肪酸水平。采用TTC、H&E、尼氏（Nissl）和盧克索固藍(lán)（髓鞘染色）染色評(píng)估腦組織病理變化。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法和免疫組化驗(yàn)證腦梗死后JAK2-STAT3通路蛋白表達(dá)。采用CCK8法驗(yàn)證FYXN對(duì)大鼠和人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性的影響。

結(jié)果

FYXN中黃酮類化合物含量最高（24.09%），其次為萜類（12.8%）、苯丙素類（12.5%）和氨基酸類（11.28%）。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示FYXN與腦梗死存在131個(gè)共同作用靶點(diǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)YXN顯著減小MCAO模型大鼠梗死面積（p < 0.05），改善Zea Longa評(píng)分（p < 0.05），增強(qiáng)肢體抓握力。病理染色顯示其改善神經(jīng)元損傷，并顯著增加尼氏體密度（P < 0.05）。與假手術(shù)組相比，MCAO組腸道菌群豐富度和多樣性指數(shù)顯著降低（p < 0.05，Cohen's d > 0.8）。丁酸鹽水平與神經(jīng)元損傷呈顯著負(fù)相關(guān)（R = -0.6，p = 0.041），且丁酸鹽可降低Zea Longa神經(jīng)功能評(píng)分（p < 0.05，Cohen's d > 0.8），提高大鼠肢體抓握力（p < 0.01），未觀察到明顯脫髓鞘現(xiàn)象，此趨勢(shì)與尼莫地平一致。轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測(cè)FYXN具有JAK2、STAT3、EGFR等治療腦梗死的關(guān)鍵靶點(diǎn)。大鼠腦組織蛋白檢測(cè)顯示，與MCAO組相比，F(xiàn)YXN低、高劑量組均顯著上調(diào)JAK2（倍數(shù)變化>2）、p-STAT3（倍數(shù)變化>2）和VEGF（倍數(shù)變化>2）表達(dá)，同時(shí)降低caspase-3表達(dá)水平。體外CCK8實(shí)驗(yàn)證實(shí)FYXN顯著促進(jìn)大鼠和人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖（p < 0.01）。

結(jié)論

FYXN治療可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道脂肪酸代謝和潛在激活JAK2-STAT3通路，改善實(shí)驗(yàn)性腦卒中模型的腦梗死面積和神經(jīng)功能缺損，為后續(xù)臨床研究提供理論科學(xué)依據(jù)。

圖文摘要

【前言】

缺血性腦梗死是一種由血栓阻塞腦血管引起的疾病，導(dǎo)致腦組織缺血缺氧，繼而誘發(fā)神經(jīng)元損傷和功能障礙。目前，缺血性腦卒中的治療主要側(cè)重于恢復(fù)缺血半暗帶的血流。溶栓和取栓治療已被證明可通過(guò)重建缺血區(qū)域血流來(lái)改善患者預(yù)后。然而，根據(jù)Marko等人 (2020) 的研究，在隊(duì)列人群中溶栓治療的頻率有限，預(yù)計(jì)到2025年僅增長(zhǎng)24%。有限的治療時(shí)間窗意味著缺血性腦卒中的發(fā)病率和致殘率仍然很高，給臨床醫(yī)生、社會(huì)及家庭帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)。因此，尋找預(yù)防和治療缺血性腦卒中的有效藥物是一個(gè)具有重要意義且至關(guān)重要的醫(yī)學(xué)研究課題。

血管生成和血流增加已被證明是促進(jìn)缺血性腦卒中恢復(fù)過(guò)程的有利條件。腦血管細(xì)胞的增殖和側(cè)支循環(huán)的重建在一定程度上決定了神經(jīng)元的再生與凋亡 。血管生成過(guò)程受多種因素復(fù)雜相互作用的調(diào)控，包括各種生長(zhǎng)因子（如IL-6、IL-10、胰島素樣生長(zhǎng)因子和VEGF）以及晝夜節(jié)律 。鑒于這種復(fù)雜性，我們?nèi)绾尾拍苷业侥軌蛘{(diào)控血管細(xì)胞增殖的有效物質(zhì)？近年來(lái)，中醫(yī)藥（TCM）在缺血性腦卒中治療領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。無(wú)論是中藥復(fù)方 還是單味藥成分均被證明可以促進(jìn)血管生成并改善缺血性腦卒中的結(jié)局。研究表明，JAK2-STAT3通路在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中能有效治療腦缺血性疾病。

新出現(xiàn)的證據(jù)表明，調(diào)控腸道菌群及其代謝物可在缺血性腦卒中的治療中發(fā)揮作用 。因此，探索與腸道菌群相關(guān)的新靶點(diǎn)和新策略以提高缺血性腦卒中的療效和患者預(yù)后至關(guān)重要。腸道菌群通過(guò)腸-腦軸與中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行雙向通信 。短鏈脂肪酸（SCFAs）是腸道細(xì)菌發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物，可能作為以微生物群為靶點(diǎn)的干預(yù)措施的潛在介質(zhì)，用以調(diào)節(jié)大腦情緒和認(rèn)知功能。然而，鑒于腸道菌群的復(fù)雜性和動(dòng)態(tài)性，需要進(jìn)一步研究以闡明靶向腸道菌群及其代謝物治療缺血性腦卒中的益處。

根據(jù)中醫(yī)理論，在正氣（氣）虛弱的基礎(chǔ)上，體內(nèi)病理產(chǎn)物（痰和瘀血）積聚，導(dǎo)致痰瘀互結(jié)。氣虛導(dǎo)致推動(dòng)血液運(yùn)行的動(dòng)力不足，最終表現(xiàn)為中風(fēng)。在復(fù)元醒腦湯（FYXN Decoction）方中，人參（Panax ginseng C.A.Mey）可大補(bǔ)元?dú)?。天南星（Arisaema erubescens (Wall) Schott）、石菖蒲（Acorus tatarinowii Schott）、水蛭（Whitmania pigra Whitman）、三七（Panax notoginseng (Burk) F.H. Chen）、益母草（Leonurus japonicus Houtt）善于祛瘀化痰、活血通竅。制大黃（Rheum palmatum L）具有強(qiáng)大的抗炎活性并能恢復(fù)腸道穩(wěn)態(tài)，從而通過(guò)菌群-腸-腦軸對(duì)缺血性腦卒中發(fā)揮治療作用 。這些草藥配伍使用可以補(bǔ)益五臟之氣，祛除瘀血，確保氣血暢通，從而防治中風(fēng)。在我們先前的研究中，我們報(bào)道了FYXN傳統(tǒng)上用于“祛瘀生新” ，并探討了FYXN改善缺血性腦卒中的治療機(jī)制。我們前期的研究表明FYXN可以促進(jìn)VEGF水平；然而，對(duì)于JAK2-STAT3通路仍需更多證據(jù)。但我們研究的新穎之處在于，我們能否從多角度進(jìn)一步闡明藥物、靶點(diǎn)與通路之間的相互作用。例如，通過(guò)整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等多組學(xué)數(shù)據(jù)，我們旨在闡明FYXN的潛在作用機(jī)制，識(shí)別潛在靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物，并為治療干預(yù)提供精確證據(jù)。這將為未來(lái)的臨床研究奠定理論基礎(chǔ)。

在本研究中，我們假設(shè)FYXN通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群衍生的SCFAs和激活JAK2-STAT3通路來(lái)改善腦梗死（CI）。為驗(yàn)證這一假設(shè)，我們首先采用UPLC-MS/MS技術(shù)鑒定了FYXN的成分及含藥血清的代謝成分。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將藥物成分的作用靶點(diǎn)與疾病作用靶點(diǎn)相結(jié)合，從而預(yù)測(cè)關(guān)鍵分子靶點(diǎn)。在體內(nèi)部分，通過(guò)線栓法阻塞大鼠大腦中動(dòng)脈制作腦梗死模型。結(jié)合RNA-seq轉(zhuǎn)錄組學(xué)和DIA蛋白質(zhì)組學(xué)，預(yù)測(cè)FYXN治療后腦組織中的關(guān)鍵通路靶點(diǎn)。評(píng)估腦缺血大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分和肢體抓握力喪失情況。對(duì)腦組織切片進(jìn)行TTC和H&E染色，觀察大鼠M1皮層和海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元。采用尼氏（Nissl）染色觀察尼氏體，并對(duì)胼胝體進(jìn)行髓鞘染色以評(píng)估腦梗死模型的病理變化。采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。檢測(cè)了大鼠腸道菌群群落及其代謝物，并利用16S rRNA測(cè)序和GC-MS技術(shù)研究了丁酸鈉對(duì)MCAO模型大鼠的功能改善作用。在體外部分，我們使用FYXN研究其對(duì)人和大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響，闡明其對(duì)該細(xì)胞增殖的作用。

【結(jié)果部分】

1.FYXN的體外物質(zhì)基礎(chǔ)與體內(nèi)代謝成分。

圖1. FYXN的體外物質(zhì)基礎(chǔ)與體內(nèi)代謝成分。（A-B）FYXN在正離子模式和負(fù)離子模式下的總離子流色譜圖。（C）FYXN化合物成分鑒定結(jié)果。（D）佛手柑內(nèi)酯（Bergapten）。（E）三甲基甘氨酸（Trimethylglycine）。（F）α-亞麻酸（α-linolenic acid）。（G）Mesifurane。（H）2-己烯醛（2-hexenal）。（I-J）FYXN含藥代謝血清在正離子模式和負(fù)離子模式下的總離子流色譜圖。（K）FYXN含藥代謝血清化合物成分鑒定結(jié)果。

2.FYXN在CI治療中的潛在組成部分和靶點(diǎn)。

圖2. 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析法用于研究FYXN在治療CI中的作用。（A）在Genecards、OMIM、PharmGKB和DisGeNet數(shù)據(jù)庫(kù)中CI的目標(biāo)基因。（B）CI和FYXN目標(biāo)基因的交集。（C）草藥-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。（D）蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。（E）FYXN治療CI的樞紐基因。（F）對(duì)20個(gè)樞紐基因的KEGG分析。

3.FYXN對(duì)MCAO大鼠具有保護(hù)作用，并促進(jìn)大鼠和人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。

圖3. FYXN能有效減少M(fèi)CAO大鼠的梗死和神經(jīng)功能缺損。（A）MCAO模型。（B）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。（C）腦梗死24小時(shí)后的TTC染色。（D）腦梗死面積的定量分析（n=3）。（E）Zea Longa神經(jīng)功能評(píng)分（n=4）。（F）MCAO建模前和24小時(shí)后大鼠握力測(cè)量的差異（n=6）。（G、J）每孔2500、5000、10000和20000個(gè)細(xì)胞時(shí)RBMECs/HBMECs的增殖能力（n=6）；（H、K）不同時(shí)間點(diǎn)的RBMECs（n=6）/HBMECs（n=5）；（I、L）OGD/R后的RBMECs/HBMECs（n=5）。與MCAO組相比，*P<0.05，**P<0.01；與假手術(shù)組相比，#<0.01。

4.FYXN對(duì)MCAO大鼠腦組織病理學(xué)的影響。

圖4. FYXN可緩解MCAO大鼠的病理狀況。（A）大鼠皮層（M1區(qū)域）的代表性蘇木精-伊紅（HE）染色顯微照片（比例尺=50微米）。（B）大鼠海馬（CA1區(qū)域）的HE染色（比例尺=50微米）。黑箭頭指向受損的神經(jīng)元細(xì)胞。（C）大鼠皮層的尼氏（Nissl）染色（比例尺=100微米）。（D）大鼠海馬的尼氏染色（比例尺=50微米）。（E）皮層中神經(jīng)元數(shù)量的定量分析（n=3）。（F）海馬中神經(jīng)元的數(shù)量（n=3）。

5.FYXN調(diào)節(jié)了MCAO大鼠中mRNA的表達(dá)。

圖5. 通過(guò)RNA測(cè)序分析MCAO大鼠中的差異表達(dá)基因（DEGs）和信號(hào)通路。（A）各組的基因密度圖（log2Counts）和樣本相關(guān)性分析。（B）MCAO與假手術(shù)組以及FYXN與MCAO組的差異表達(dá)基因（DEGs）的火山圖（P-adjust<0.05，F(xiàn)old change=2）。（C）兩組中差異表達(dá)基因的分布（在維恩圖中，P-adjust<0.05）和逆轉(zhuǎn)的差異表達(dá)基因（在柱狀圖中，P-adjust<0.05）。（D）MCAO大鼠中與JAK-STAT信號(hào)通路相關(guān)的基因的熱圖。（E）JAK-STAT信號(hào)通路被分為三個(gè)框：左側(cè)（假手術(shù)），中間（MCAO），右側(cè)（FYXN）。顏色的深淺隨基因表達(dá)量的增加而加深。

6.FYXN調(diào)節(jié)了MCAO大鼠中蛋白質(zhì)的表達(dá)。

圖6. MCAO大鼠中差異表達(dá)蛋白（DEPs）和顯著通路的蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（A）假手術(shù)組、MCAO組和FYXN組的PLS-DA圖。（B）MCAO與假手術(shù)組以及FYXN與MCAO組的差異表達(dá)蛋白（DEPs）的火山圖（P<0.05，F(xiàn)old change=1.5）。（C）兩組中差異表達(dá)蛋白的分布（在維恩圖中，P<0.05）和逆轉(zhuǎn)的差異表達(dá)蛋白（在柱狀圖中，P<0.01）。（D）MCAO大鼠中與JAK-STAT信號(hào)通路相關(guān)的蛋白的熱圖。（E）JAK-STAT信號(hào)通路被分為三個(gè)框：左側(cè)（假手術(shù)），中間（MCAO），右側(cè)（FYXN）。顏色的加深表示蛋白表達(dá)量的增加。

7.JAK2-STAT3激活的Western blot分析。

圖7. FYXN在腦梗死24小時(shí)后對(duì)Jak2、p-STAT3、STAT3、IL6、VEGF、NF-κB、Caspase-3和AMPK蛋白表達(dá)水平的影響。（A）Jak2/β-actin的相對(duì)蛋白水平；（B）p-STAT3/β-actin的相對(duì)蛋白水平；（C）STAT3/β-actin的相對(duì)蛋白水平；（D）IL6/β-actin的相對(duì)蛋白水平；（E）VEGF/β-actin的相對(duì)蛋白水平；（F）NF-κB/β-actin的相對(duì)蛋白水平；（G）Caspase-3/β-actin的相對(duì)蛋白水平；（H）AMPK/β-actin的相對(duì)蛋白水平。（均值±標(biāo)準(zhǔn)差；n=3；*P<0.05，**P<0.01）。（I）大鼠腦組織中STAT3和VEGF的典型免疫組化照片。

8.FYXN對(duì)MCAO大鼠腸道菌群組成的影響。

圖8. FYXN誘導(dǎo)的大鼠腸道微生物群變化。（A–B）Chao1和ACE指數(shù)反映腸道菌群的豐富度（n=4）。（C–D）Shannon和Simpson指數(shù)反映腸道菌群的多樣性（n=4）。（E）基于主坐標(biāo)分析（PCoA）和（F）相似性分析（ANOSIM）評(píng)估β多樣性。（G）線性判別分析效應(yīng)大小（LEfSe）。（H）各組間顯著豐度差異的生物標(biāo)志物（LDA值>4）。柱狀圖的長(zhǎng)度代表生物標(biāo)志物物種的貢獻(xiàn)。（I）在綱、種、屬、門、目和科水平上的腸道菌群變化。

9.FYXN通過(guò)改善腸道菌群產(chǎn)生的短鏈脂肪酸（SCFA）和丁酸鹽介導(dǎo)的神經(jīng)功能恢復(fù)。

圖9. FYXN干預(yù)后及丁酸鹽介導(dǎo)的MCAO大鼠短鏈脂肪酸（SCFA）含量檢測(cè)。（A）短鏈脂肪酸的熱圖。（B）PCA模型的得分圖。（C）PLS-DA載荷圖模型。（D）糞便中丁酸、丙酸、戊酸和異戊酸濃度的定量結(jié)果。（E）Zea Longa評(píng)分與短鏈脂肪酸含量的Spearman相關(guān)性分析。（F）丁酸對(duì)MCAO大鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。（G）大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的Zea Longa統(tǒng)計(jì)結(jié)果。（與MCAO組相比，*P<0.05；與假手術(shù)組相比，#<0.01，n=4）。（H）MCAO建模前和24小時(shí)后大鼠的握力測(cè)量（n=3）。（I）胼胝體的LFB染色切片的代表性圖像（比例尺=100微米）。

【結(jié)論與討論】

在這項(xiàng)研究中，揭示了FYXN通過(guò)調(diào)節(jié)JAK2-STAT3信號(hào)通路，促進(jìn)VEGF表達(dá)和血管生成，從而改善MCAO大鼠的神經(jīng)功能缺損。此外，F(xiàn)YXN還通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群產(chǎn)生的短鏈脂肪酸（SCFA），特別是丁酸鹽，間接促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。然而，研究存在局限性：未通過(guò)基因敲除或藥理抑制等方法直接驗(yàn)證FYXN對(duì)JAK2-STAT3通路的作用，且未評(píng)估FYXN對(duì)全身代謝（如肝腎功能）的潛在影響，這些影響可能間接調(diào)節(jié)觀察到的結(jié)果。未來(lái)研究需進(jìn)一步驗(yàn)證FYXN的作用機(jī)制，并深入探討其對(duì)全身代謝的潛在影響。

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