多重基因編輯（Multiplex Gene Editing）是指在同一實驗或生物體中，同時對多個基因進行編輯的技術(shù)，這種技術(shù)通常使用 CRISPR-Cas9 等基因編輯工具，能夠高效、精準地修改多個目標基因，用于研究復(fù)雜生物學問題或模擬特定性狀。

猛犸象（Mammoth）是一種已經(jīng)滅絕的古代象科動物，生活在距今約 480 萬年至 4000 年前更新世時期，它們?nèi)砀采w濃密的長毛，毛發(fā)長度可達 50 厘米，顏色通常為棕色或黑色，幫助它們在冰河時期的寒冷環(huán)境中保暖。但在距今約 1 萬年前，因為氣候變化等原因，適應(yīng)寒冷氣候的猛犸象快速滅絕，大約 5000 年前，猛犸象徹底滅絕，這也標志著冰河世紀的結(jié)束。目前科學家正在嘗試通過基因編輯技術(shù)（如 CRISPR）和克隆技術(shù)，利用猛犸象的 DNA 復(fù)活這一物種，或?qū)⑵浠蛞氍F(xiàn)代亞洲象，以恢復(fù)其部分特征。

2025 年 3 月，喬治 · 丘奇團隊在bioRxiv發(fā)表研究「Multiplex-edited mice recapitulate woolly mammoth hair phenotypes」（圖 1）。該研究指出長毛猛犸象（Mammuthus primigenius）擁有厚密的毛發(fā)和其他適應(yīng)寒冷的特征，使其能夠在嚴酷的北極環(huán)境中生存。當前的去滅絕（de-extinction）努力集中在通過基因改造與其親緣關(guān)系密切的亞洲象，使其表達長毛猛犸象的特征。

在本研究中，該團隊建立了一個多重基因編輯的小鼠模型，對與毛發(fā)形態(tài)和脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因進行了編輯，成功同時編輯了多達 7 個不同的基因，結(jié)果顯示，編輯后的小鼠表現(xiàn)出顯著的毛發(fā)表型，包括卷曲、質(zhì)地粗糙的毛發(fā)以及金棕色的毛發(fā)顏色。

這項研究建立了一個快速測試猛犸象相關(guān)基因變異的平臺，同時推進了復(fù)雜遺傳模型的生成方法，這些方法為去滅絕研究以及哺乳動物毛發(fā)發(fā)育和寒冷適應(yīng)的遺傳基礎(chǔ)研究提供了重要信息。

圖 1：相關(guān)研究（圖源：[1]）

猛犸象「去滅絕」計劃的目標是什么呢？其目標是通過在與其親緣關(guān)系密切的亞洲象的細胞中表達猛犸象特有的基因變異，復(fù)活猛犸象的關(guān)鍵表型特征，如厚密的毛發(fā)和其他適應(yīng)寒冷環(huán)境的特征。隨后通過體細胞核移植和代孕實現(xiàn)，這些特征的基因變異選擇通過比較基因組分析進行，并在可能的情況下通過實驗驗證其預(yù)測的表型效應(yīng)。但是現(xiàn)在面臨實驗周期長和倫理問題的挑戰(zhàn)，因此需要開發(fā)替代方法進行功能驗證。

在現(xiàn)在這個時代，我們怎么才能對大約在 4000 年前就已經(jīng)滅絕的長毛猛犸象進行去滅絕研究呢？小鼠模型系統(tǒng)為探索猛犸象去滅絕相關(guān)基因修飾的表型影響提供了一種強有力的替代方法，小鼠的妊娠期僅為 20 天，且基因操作技術(shù)成熟，能夠快速進行候選基因變異的功能測試。而 CRISPR/Cas9 技術(shù)推動了基因編輯動物模型的發(fā)展，加速了復(fù)雜遺傳模型的生成，并對去滅絕等雄心勃勃的保護工作具有重要意義。

先前對自發(fā)和工程化小鼠突變的研究揭示了毛發(fā)發(fā)育、質(zhì)地、長度、密度和顏色的關(guān)鍵遺傳調(diào)控因子（包括導(dǎo)致毛發(fā)呈波浪狀的 Tgm3 基因、控制毛囊方向的 Fzd6 基因和 Astn2 基因，以及影響毛發(fā)質(zhì)地的 Fam83 g 基因，調(diào)控毛發(fā)長度的 Fgf5 基因，調(diào)控毛發(fā)發(fā)育的 Tgfa 基因）。此外，Krt25 和 Krt27 基因的突變也會改變毛發(fā)結(jié)構(gòu)，而 Mc1r 基因則調(diào)節(jié)毛發(fā)顏色，這些都為猛犸象去滅絕研究中毛發(fā)特征的基因編輯提供了理論基礎(chǔ)。

喬治 · 丘奇團隊通過小鼠模型系統(tǒng)及多重基因編輯技術(shù)達成了什么樣的成果呢？在本篇研究中，他們構(gòu)建了一組多重基因編輯的小鼠模型，這些模型攜帶了 Tgm3、Fzd6、Astn2、Fam83 g、Fgf5、Tgfa 和 Mc1r 基因的功能缺失突變（LOF）。這些基因的選擇基于先前對小鼠被毛表型的觀察，以及對猛犸象和亞洲象基因組的比較分析。

例如，Tgfa 基因在猛犸象譜系中與亞洲象分化后出現(xiàn)了類似的功能缺失變異。他們還在 Krt25 和 Krt27 中引入了精確的錯義突變，其中 Krt27 的突變位點在猛犸象中也被固定。此外，他們還選擇了與脂肪代謝相關(guān)的基因 Fabp2，該基因在猛犸象中存在早期終止密碼子。

小鼠 Fabp2 基因的破壞會導(dǎo)致性別依賴的代謝紊亂和脂肪分布差異，表明其在寒冷適應(yīng)中可能起作用。他們采用直接受精卵編輯（圖 2）和高效嵌合體方法（圖 2）構(gòu)建小鼠默許，成功實現(xiàn)了在 7 個不同基因中同時進行多達 8 個純合編輯。這些新穎的基因修飾組合產(chǎn)生了多種毛發(fā)表型的小鼠，為猛犸象去滅絕研究和毛囊生物學的基礎(chǔ)研究提供了重要工具。

圖 2：目標性狀、目標基因和編輯工作流程概述（圖源：[1]）

局限性：小鼠模型為評估基因修飾的功能后果提供了實驗上易于操作的系統(tǒng)，但其毛囊生物學和生理參數(shù)可能與長鼻類動物（如猛犸象）不同，這與人類的情況類似。此外，猛犸象的寒冷適應(yīng)表型可能涉及復(fù)雜的生理修飾，不僅限于毛發(fā)形態(tài)，還包括脂肪分布、血管結(jié)構(gòu)和代謝性體溫調(diào)節(jié)的變化。

本研究建立的多重基因編輯策略和小鼠模型為評估導(dǎo)致猛犸象表型的復(fù)雜基因修飾組合提供了基礎(chǔ)，未來的工作將評估與其他寒冷適應(yīng)特征相關(guān)的猛犸象特異性變異。此外，本研究展示的多重基因編輯技術(shù)進展對基礎(chǔ)研究和治療應(yīng)用具有重要意義，這些技術(shù)能夠精確協(xié)調(diào)多個基因修飾，為需要復(fù)雜基因操作的領(lǐng)域提供了新工具。

喬治 ·M· 丘奇（George M. Church）是美國著名的遺傳學家、分子工程師和生物技術(shù)領(lǐng)域先驅(qū)，在基因組學、合成生物學和基因編輯領(lǐng)域做出了許多開創(chuàng)性貢獻，也是猛犸象去滅絕（de-extinction）研究的重要推動者之一。

基因組測序和基因編輯技術(shù)（如 CRISPR-Cas9）的快速發(fā)展，使得復(fù)活已滅絕物種成為可能，猛犸象是去滅絕研究的主要目標之一，因為其基因組已被完整測序，且其近親亞洲象（Elephas maximus）仍存活。在 2024 年，Colossal Biosciences 宣布成功重編程大象（亞洲象）誘導(dǎo)多能干細胞（iPSC），將大象的成熟皮膚細胞重編程為胚胎狀態(tài)，這項研究是實現(xiàn)其復(fù)活猛犸象項目的重要里程碑。該公司計劃明年生產(chǎn)出具有猛犸象特征的亞洲象胚胎，并在 2028 年生產(chǎn)出第一批猛犸象。

Colossal 由喬治 · 丘奇（George Church）等人創(chuàng)立，是第一家將 CRISPR 技術(shù)應(yīng)用于物種恢復(fù)、極度瀕危物種保護及關(guān)鍵生態(tài)系統(tǒng)重建的公司。該研究同樣于 2024 年 3 月 6 日在預(yù)印本平臺《bioRxiv》發(fā)布，論文題「Derivation of Elephant Induced Pluripoten Stem Cells」[3]。

喬治 · 丘奇表示，如果有一個「最難重編程獎」，那么大象應(yīng)該能獲獎。但無論如何，學習如何重編程將有助于許多其他研究，特別是對瀕危物種的研究。這一里程碑成果為我們提供了關(guān)于發(fā)育生物學和衰老與癌癥之間的平衡的見解。它為在珍稀動物身上不進行手術(shù)獲取配子和其他細胞類型打開了大門。它為現(xiàn)代動物與其已滅絕親屬之間建立基因和特征之間的聯(lián)系打開了大門，包括對極端環(huán)境和病原體的抵抗力。

參考文獻：

[1] https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.03.03.641227v1

[2] MEZRICH B, CHURCH G M, BRAND S. Woolly : the true story of the de-extinction of one of history's most iconic creatures [Z]. New York, NY; Simon & Schuster Audio,. 2017.9781508243595

[3] https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.03.05.583606v1

圖片來源： bioRxiv

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