貓傳染性腹膜炎病毒（FIPV）可引起對(duì)貓科動(dòng)物致命的免疫介導(dǎo)性疾病，但目前臨床上仍缺乏疫苗提供的有效保護(hù)。冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp14和nsp16的甲基轉(zhuǎn)移酶（MTase）活性會(huì)影響病毒毒力，但尚未有研究探討影響酶活的nsp14與nsp16突變對(duì)FIPV毒力的作用。本研究基于前期構(gòu)建的感染性克隆QS-79，通過(guò)定點(diǎn)突變nsp14（N415）和nsp16（D129）的MTase活性位點(diǎn)，成功拯救出兩株分別命名為FIPV QS-79 dnsp14與dnsp16的突變毒株。突變株在體外表現(xiàn)出與親本毒株相似的合胞體形成能力和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特征，并在巨噬細(xì)胞系中顯著刺激干擾素及細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，dnsp14與dnsp16對(duì)貓的致病性顯著降低，死亡率較野生型毒株下降75%。以高劑量（105 TCID50）和低劑量（104 TCID50）對(duì)貓進(jìn)行免疫接種時(shí)，dnsp14在兩種劑量下均能誘導(dǎo)高效價(jià)中和抗體（>1:156），而dnsp16僅能誘導(dǎo)低水平中和抗體（<1:64）；攻毒試驗(yàn)中dnsp14在兩種免疫劑量下均可為50%的貓?zhí)峁┍Ｗo(hù)，而dnsp16未能提供有效保護(hù)。上述結(jié)果表明兩種突變株對(duì)貓的致病性均減弱，且dnsp14比dnsp16能誘導(dǎo)更好的體液免疫反應(yīng)與保護(hù)效果。

結(jié)果

1、FIPV nsp14 N415和nsp16 D129是關(guān)鍵的MTase 活性位點(diǎn)

基于先前的研究，發(fā)現(xiàn)完全敲低nsp14或nsp16的MTase活性會(huì)導(dǎo)致病毒無(wú)法被拯救。為了制定獲得能在細(xì)胞中復(fù)制的重組突變FIPV的策略，我們通過(guò)序列比對(duì)分析了FIPV 79-1146、PEDV CV777、MHV A59、TGEV WH-1、SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1、SARS-CoV Tor2和MERS-CoV EMC。發(fā)現(xiàn)nsp14和nsp16的MTase活性位點(diǎn)在多種冠狀病毒中高度保守，最終確定nsp14第415位的天冬酰胺和nsp16第129位的天冬氨酸為突變靶點(diǎn)（圖1A）。通過(guò)AlphaFold2在線網(wǎng)站對(duì)FIPV QS-79親本株及dnsp14和dnsp16突變株進(jìn)行了結(jié)構(gòu)模擬，并使用AutoDock Vina預(yù)測(cè)了野生型和突變株的SAM結(jié)合口袋。如圖所示，分子對(duì)接表明，nsp14 N415位點(diǎn)的側(cè)鏈參與β-鏈的形成，并與鄰近的α-螺旋共同形成一個(gè)穩(wěn)定帽核結(jié)構(gòu)（GPPPA）和SAM的口袋，促進(jìn)nsp14參與RNA帽添加的甲基轉(zhuǎn)移過(guò)程（圖1B）。當(dāng)?shù)?15位的氨基酸突變?yōu)楸彼釙r(shí)，nsp14 415位點(diǎn)與鳥苷磷酸基團(tuán)上的氧原子之間的氫鍵形成被破壞（圖1C）。nsp16的模擬結(jié)果顯示，第129位的天冬氨酸位于SAM結(jié)合口袋內(nèi)更靠近m7G（cap-0結(jié)構(gòu)）的位置，該位點(diǎn)與口袋內(nèi)的其他氨基酸通過(guò)分子間相互作用來(lái)穩(wěn)定SAM并將其朝向m7G定位（圖1D和E）。為了驗(yàn)證這兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)酶活性的影響，我們表達(dá)了FIPV QS-79 nsp16、nsp14、nsp10、nsp14 N415A位點(diǎn)突變和nsp16 D129A位點(diǎn)突變蛋白，然后使用相應(yīng)的底物測(cè)量了MTase活性。結(jié)果顯示，nsp14 N415和nsp16 D129突變的甲基轉(zhuǎn)移酶活性大大降低（圖1F）。這些結(jié)果證明nsp14 N415位點(diǎn)和nsp16 D129位點(diǎn)是關(guān)鍵的MTase活性位點(diǎn)；同時(shí)，nsp14和nsp16參與了FIPV QS-79 RNA帽結(jié)構(gòu)的甲基化。

2、突變FIPV毒株dnsp14和dnsp16的拯救

通過(guò)體外CRISPR-Cas9技術(shù)操作病毒基因組，以設(shè)計(jì)QS-79 nsp14和QS-79 nsp16酶活性缺失的重組突變體。首先，我們進(jìn)行了sgRNA體外轉(zhuǎn)錄和瓊脂糖凝膠電泳鑒定。片段大小正確，完整性和純度得到確認(rèn)（圖2A）。使用Cas9酶和sgRNA消化QS-79 BAC質(zhì)粒，成功產(chǎn)生線性化載體和包含目標(biāo)基因的片段（圖2B）。通過(guò)融合PCR進(jìn)行定點(diǎn)突變，成功產(chǎn)生了兩個(gè)基因片段，一個(gè)用于nsp14 N415A位點(diǎn)突變，一個(gè)用于nsp16 D129A位點(diǎn)突變（圖2C和D）。通過(guò)轉(zhuǎn)化將突變片段和BAC質(zhì)粒進(jìn)行重組結(jié)合，并對(duì)所得質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，nsp14的第415位和nsp16的第129位均突變?yōu)榫幋a丙氨酸，表明dnsp14 BAC和dnsp16 BAC構(gòu)建成功（圖2E）。將dnsp14 BAC、dnsp16 BAC和陽(yáng)性對(duì)照QS-79 BAC通過(guò)轉(zhuǎn)染插入HEK-293T細(xì)胞，24小時(shí)后，用細(xì)胞上清液感染CRFK細(xì)胞36小時(shí)。進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，并成功檢測(cè)到FIPV病毒N蛋白（圖2F和G），證明dnsp14和dnsp16突變株已在CRFK細(xì)胞中成功拯救。

3、dnsp14和dnsp16在體外未表現(xiàn)出增殖能力減弱但誘導(dǎo)增強(qiáng)的免疫反應(yīng)

為了表征突變株dnsp14和dnsp16在體外的生物學(xué)特性，我們以0.01的感染復(fù)數(shù)（MOI）用dnsp14、dnsp16和QS-79感染CRFK和Fcwf-4細(xì)胞，并每12小時(shí)收集病毒細(xì)胞上清液進(jìn)行TCID50測(cè)定。生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線表明，突變株與親本株在感染兩種細(xì)胞系后，各時(shí)間點(diǎn)的增殖趨勢(shì)、病毒滴度和峰值病毒滴度均無(wú)顯著差異（圖3A和B）。病毒合胞體形成實(shí)驗(yàn)也顯示，突變株與親本株感染的合胞體形成能力無(wú)顯著差異（圖3C）。以MOI為0.01的劑量感染Fcwf-4細(xì)胞并總共培養(yǎng)24小時(shí)，提取細(xì)胞RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，dnsp14和dnsp16誘導(dǎo)了顯著更高水平的IFN-β和ISG15的mRNA表達(dá)（圖3D和E）。此外，觀察到感染dnsp16突變株的細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)顯著增加，而dnsp14突變株與QS-79親本株感染后的TNF-α表達(dá)水平無(wú)顯著差異（圖3F）。這些結(jié)果表明，QS-79 nsp14 N415A位點(diǎn)突變和nsp16 D129A位點(diǎn)突變不影響病毒在體外的增殖能力，但重組病毒能誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。

4、dnsp14和dnsp16在體內(nèi)的致病性減弱

使用成年貓的口服攻毒模型來(lái)評(píng)估突變株的體內(nèi)致病性（圖4A）。將十六只健康成年貓隨機(jī)分為四組，每組四只；三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的貓分別口服接種1 mL 105.5 TCID50/mL的dnsp14、dnsp16和QS-79，模擬組貓口服接種1 mL無(wú)菌PBS?；谑秤?、精神狀態(tài)、眼鼻分泌物、糞便排泄和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀進(jìn)行臨床評(píng)分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，感染QS-79株的成年貓?bào)w溫升高和體重減輕，而dnsp14和dnsp16感染組的貓?jiān)谡麄€(gè)試驗(yàn)期間沒有出現(xiàn)持續(xù)性發(fā)熱（圖4B和C）。dnsp14組貓的體重在感染1周后輕微下降，并在后期逐漸恢復(fù)。dnsp16組貓的體重沒有下降，模擬組貓沒有出現(xiàn)體溫升高或體重減輕。QS-79組成年貓的臨床癥狀在感染后持續(xù)惡化，表現(xiàn)為精神抑郁、食欲不振、眼鼻有炎性分泌物以及排泄減少。dnsp14組貓表現(xiàn)出食欲不振、精神抑郁以及體重減輕，但這些臨床表現(xiàn)隨著體重的恢復(fù)而消失，其總體臨床評(píng)分顯著低于QS-79感染組貓；同時(shí)，dnsp16組貓的臨床癥狀與模擬組貓沒有差異，未發(fā)現(xiàn)明顯的FIP臨床癥狀（圖4D）。淋巴細(xì)胞減少是FIP的典型特征，血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果顯示，QS-79感染組的淋巴細(xì)胞數(shù)量在1周后降至基線水平以下，而dnsp14和dnsp16感染組以及模擬組的淋巴細(xì)胞數(shù)量在整個(gè)試驗(yàn)期間均在正常范圍內(nèi)波動(dòng)（圖4E）。中和抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，感染QS-79、dnsp14和dnsp16的成年貓能誘導(dǎo)中和抗體水平升高。感染dnsp14誘導(dǎo)的抗體水平與QS-79感染無(wú)顯著差異，感染dnsp16誘導(dǎo)的抗體水平低于其他兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，模擬組未產(chǎn)生中和抗體（圖4F）。檢測(cè)了先天免疫基因的表達(dá)，如IFN-β、ISG15和IFITM1，結(jié)果顯示與qs-79感染后的高表達(dá)相比，dnsp14和dnsp16感染降低了這些基因的表達(dá)（圖S1）。死亡率結(jié)果顯示，QS-79組的所有成年貓?jiān)?周內(nèi)死亡，三只貓?jiān)诟腥竞?周內(nèi)死亡，最后一只死亡的貓病程較長(zhǎng)，在感染后第59天死亡。dnsp14組的一只貓?jiān)诠ザ竞蟮?6天死亡，dnsp16組的一只貓?jiān)诠ザ竞蟮?4天死亡，模擬組無(wú)貓死亡（圖4G）。分別在第36天、第44天、第59天和第59天對(duì)dnsp14、dnsp16、QS-79和MOCK組進(jìn)行解剖和病理學(xué)檢查。根據(jù)解剖和病理學(xué)檢查，QS-79組的肉眼病變明顯，在肝臟、腎臟和脾臟觀察到典型的FIP非干酪樣肉芽腫，dnsp14和dnsp16組出現(xiàn)纖維蛋白性漿膜炎和化膿性肉芽腫，腎臟無(wú)明顯病變，模擬組的肝臟、腎臟和脾臟無(wú)明顯病變（圖4I）。蘇木精-伊紅（H&E）染色顯示上述病變處有顯著的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞壞死，但dnsp14和dnsp16組的病變嚴(yán)重程度低于QS-79組，模擬組組織形態(tài)完整，無(wú)炎癥浸潤(rùn)（圖4J）。免疫組化結(jié)果顯示，在QS-79感染貓的肝臟、脾臟和腎臟中檢測(cè)到FIPV N蛋白，證明QS-79感染貓的器官病變是由FIPV引起的。在dnsp14和dnsp16感染貓的肝臟和脾臟中也觀察到表明發(fā)病區(qū)域的棕色染色信號(hào)，腎臟無(wú)顯著陽(yáng)性信號(hào)，模擬組任何貓均無(wú)陽(yáng)性信號(hào)（圖4K）。組織器官病毒載量檢測(cè)顯示，dnsp16組的病毒載量顯著低于QS-79組和dnsp14組，僅在脾臟和肺部檢測(cè)到病毒顆粒（圖4H）。這些結(jié)果表明，兩種突變株在體內(nèi)成功減毒。

5、降低免疫劑量降低了dnsp16免疫的死亡率但不影響dnsp14免疫

突變株在105.5 TCID50劑量下仍有25%的死亡率，因此通過(guò)降低免疫劑量盡可能提高突變株免疫的安全性。對(duì)于dnsp14和dnsp16突變株，設(shè)計(jì)了高劑量（105 TCID50）和低劑量（104 TCID50）免疫組，相應(yīng)的貓通過(guò)兩次口服劑量和一次皮下注射進(jìn)行免疫，每次間隔21天（圖5A）。對(duì)照組貓以相同方式免疫1 mL無(wú)菌PBS。結(jié)果顯示，dnsp14的死亡率不具劑量依賴性，在高劑量和低劑量免疫后均有三分之一的貓死亡（圖5B）。dnsp14突變株在高劑量免疫三次后，在所有貓中誘導(dǎo)了1:1024的中和抗體滴度。在低劑量免疫三次后，免疫貓的平均抗體滴度超過(guò)1:256，但有一只貓?jiān)谌蚊庖吆笪串a(chǎn)生中和抗體（圖5D）。dnsp16突變株在高劑量下死亡率為25%，而在低劑量下免疫的貓100%存活（圖5C）。dnsp16突變株在兩種免疫劑量下誘導(dǎo)的中和抗體水平均低于dnsp14，并且低劑量免疫的貓中有一半未產(chǎn)生中和抗體（圖5E）?？傊?，盡管dnsp14突變株在高和低免疫劑量下均能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)并產(chǎn)生高水平中和抗體，但其免疫安全性仍需提高；低劑量免疫dnsp16突變株的成年貓存活率為100%，但該突變株在該劑量下誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)較弱，僅產(chǎn)生低水平中和抗體。

6、50%的貓?jiān)赿nsp14免疫組中能夠抵抗高致病性毒株QS-79的攻毒

在首次免疫后第80天，所有貓均用1 mL 105.5 TCID50/mL QS-79進(jìn)行攻毒試驗(yàn)（每組n=4）。結(jié)果顯示，PBS免疫組、dnsp14高劑量免疫組和dnsp14低劑量免疫組的貓?jiān)诟腥竞罅⒓闯霈F(xiàn)體溫升高和體重減輕的臨床癥狀，PBS組貓的臨床癥狀最嚴(yán)重，所有貓?jiān)诟腥酒陂g均出現(xiàn)發(fā)熱（圖6A和B）。臨床評(píng)分結(jié)果顯示，PBS組中50%的貓?jiān)诟腥局衅诔霈F(xiàn)繼發(fā)性細(xì)菌感染，所有貓?jiān)谒劳霎?dāng)天出現(xiàn)嚴(yán)重的FIP癥狀，包括呼吸窘迫和后肢癱瘓，而dnsp14免疫組的動(dòng)物均出現(xiàn)較輕的癥狀，未出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀或呼吸窘迫。dnsp14低劑量和高劑量免疫分別將成年貓的發(fā)病時(shí)間推遲了1周和2周（圖6C）。PBS組的所有貓?jiān)诠ザ竞?9天內(nèi)死亡，而所有dnsp14免疫組中50%的動(dòng)物受到保護(hù)，免于高致病性毒株QS-79的侵害，除了低劑量組中一只未產(chǎn)生抗體的貓?jiān)诠ザ竞蟮?0天死亡，其他dnsp14免疫的成年貓則表現(xiàn)出延長(zhǎng)的存活期（圖6D）。血常規(guī)和生化分析顯示，所有免疫了dnsp14突變株的貓?jiān)诠ザ竞缶憩F(xiàn)出淋巴細(xì)胞水平的短暫下降，fSAA水平在攻毒后逐漸升高，其中低劑量免疫組在感染后恢復(fù)更快（圖6E）。淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)在攻毒后持續(xù)下降，fTBIL、fALT和fAST水平在攻毒后持續(xù)升高，fAST水平在感染第一周結(jié)束時(shí)遠(yuǎn)高于正常范圍（圖6F至I）。dnsp14免疫組貓的fALT和fAST水平在攻毒后升高了3-4周，然后逐漸恢復(fù)正常。PBS組的生化和血常規(guī)檢測(cè)異常是不可逆的。對(duì)實(shí)驗(yàn)組貓進(jìn)行了病理學(xué)分析和病毒載量測(cè)量。解剖顯示，dnsp14免疫組貓?jiān)诓《竟ザ竞螅I臟出現(xiàn)典型的FIPV感染肉芽腫病變（白色箭頭所示），而其他器官的病變嚴(yán)重程度低于PBS免疫貓（圖6J）。通過(guò)H&E染色，在所有三個(gè)實(shí)驗(yàn)組貓的肝臟、腎臟和脾臟中均觀察到顯著的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。dnsp14高劑量免疫組貓?jiān)诠ザ竞蟾闻K未顯示顯著的FIP病變特征，但H&E染色顯示肝組織中出現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹和胞質(zhì)空泡化（圖6K）。免疫組化結(jié)果顯示，所有三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中肝臟、腎臟和脾臟的病理?yè)p傷均由FIPV感染引起（圖6L）。dnsp14高劑量免疫攻毒組和PBS免疫攻毒組的器官病毒載量顯著升高。dnsp14高劑量免疫攻毒組在盲腸、大腦和小腦中的病毒載量低于檢測(cè)限，在肝臟、脾臟、肺和淋巴結(jié)中的病毒載量較低（圖6M）。上述數(shù)據(jù)表明，dnsp14突變株可以誘導(dǎo)高水平的中和抗體并為成年貓?zhí)峁┎糠直Ｗo(hù)。以不同免疫劑量施用dnsp14突變株在成年貓中提供了一致的保護(hù)，50%的成年貓能抵抗高致病性毒株QS-79，而死亡的50%的貓其由FIPV感染引起的臨床表現(xiàn)和病理?yè)p傷得到緩解，并且存活期延長(zhǎng)。

7.不同劑量的dnsp16均不能防御FIPV QS-79的攻毒

在首次免疫后第80天，所有貓均用1 mL 105.5 TCID50/mL QS-79進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。結(jié)果顯示，不同劑量dnsp16免疫在注射后立即引起體溫升高和持續(xù)性發(fā)熱，貓的體重在1個(gè)月內(nèi)降至其初始體重的80%（圖7A和B）。食欲不振、抑郁、呼吸困難和共濟(jì)失調(diào)等臨床癥狀與PBS免疫組無(wú)顯著差異，臨床評(píng)分在1個(gè)月內(nèi)持續(xù)增加（圖7C）。高劑量免疫組和低劑量免疫組的貓均在30天內(nèi)自然死亡（圖7D）。三個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間的死亡率或死亡時(shí)間無(wú)顯著差異。所有三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的貓?jiān)诠ザ竞缶@示淋巴細(xì)胞水平下降，兩個(gè)dnsp16免疫組的貓下降速度比PBS組慢。并且fSAA、fTBIL、fALT和fAST水平在感染QS-79后持續(xù)升高（圖7E至I）。對(duì)死亡貓的病理剖檢顯示，dnsp16免疫后攻毒引起的器官病變非常明顯，肝臟、腎臟和脾臟出現(xiàn)典型的FIP肉芽腫病變（圖7J）。低劑量dnsp16免疫后的攻毒組肝臟和腎臟病變最為明顯，病變部位的H&E染色顯示所有組織均出現(xiàn)嚴(yán)重的病理病變。肉芽腫以壞死組織為中心，周圍結(jié)締組織有大量炎癥浸潤(rùn)（圖7K）。此外，對(duì)病變部位進(jìn)行了免疫組化檢測(cè)，所有切片均顯示強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)（圖7L）。病毒載量評(píng)估顯示，與PBS免疫組相比，免疫了dnsp16突變株的成年貓?jiān)诟闻K、脾臟、肺、腎臟、淋巴結(jié)、盲腸和大網(wǎng)膜中的病毒水平更高（圖7M）。不同dnsp16免疫劑量的攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低水平的中和抗體無(wú)法阻斷FIPV感染。攻毒后更高的臨床評(píng)分、更明顯的器官病變和更高的病毒載量表明，dnsp16疫苗接種可能誘導(dǎo)成年貓的疾病增強(qiáng)。

結(jié)論

本研究成功構(gòu)建并拯救了在nsp14 N7-MTase活性位點(diǎn)（N415）和nsp16 2'-O-MTase活性位點(diǎn)（D129）發(fā)生突變的FIPV毒株。突變株dnsp14和dnsp16在成年貓?bào)w內(nèi)的致病性均較低，其中dnsp16更不穩(wěn)定。dnsp14在免疫后誘導(dǎo)高水平中和抗體的產(chǎn)生，并能針對(duì)強(qiáng)毒FIPV攻毒提供50%的保護(hù)，而dnsp16在免疫后僅誘導(dǎo)低水平中和抗體的產(chǎn)生，并且不能防御FIPV攻毒。本研究成功構(gòu)建了一種減毒、能在宿主體內(nèi)有效復(fù)制并能提供部分保護(hù)以抵抗強(qiáng)毒親本病毒的候選疫苗，為開發(fā)針對(duì)貓冠狀病毒nsp14/nsp16 MTase的減毒活疫苗提供了參考。

來(lái)源：微生物前沿

編輯：吃一口小貓