關(guān)注生物學(xué)霸，每周更新科研干貨哦

Primer Premier 5 是一款功能全面的引物設(shè)計(jì)軟件：

1. 快速鎖定高質(zhì)量引物：其「自動搜索」功能非常強(qiáng)大，能快速找到高質(zhì)量的引物。

2. 功能全面：支持各種類型的引物設(shè)計(jì)，包括 PCR 引物、測序引物、雜交探針，以及巢式 PCR、突變引入等特殊需求。

3. 綜合分析：評估引物的 Tm 值、GC 含量，提供引物的二級結(jié)構(gòu)、特異性、物理化學(xué)性質(zhì)等全面分析。

4. 支持 DNA/RNA 序列輸入、編輯、反向互補(bǔ)、編輯等功能。

5. 支持 GenBank、FASTA 等格式的序列文件。

文末領(lǐng)取資料包

操作流程

1. 啟動軟件，從菜單欄依次點(diǎn)擊【File】—【New】—【DNA Sequence】，若操作正常，則軟件安裝成功。

2. 在 NCBI 中查找基因 cDNA/mRNA 序列 (確認(rèn)好物種類型和基因名)，這里以人類 TP53 為例，下拉選擇「Gene」，輸入「TP53 human」，點(diǎn)擊「Search」。

3. 在新界面的「GENE」 下面點(diǎn)擊「TP53?–?tumor protein p53」。

4. 在新界面的右側(cè)選擇「NCBI Reference Sequences（RefSeq）」后，界面跳轉(zhuǎn)到「mRNA and Protein(s)」中找到「NM_000546.6」，然后選擇基因的「CDS」 區(qū)，點(diǎn)擊「FASTA」。

5. 在 Primer Premier 5 中粘貼 CDS 序列，選擇「As is」，點(diǎn)擊「Ok」。

6. 點(diǎn)擊左上角的「Primer」，在彈出的新界面中選擇「Search」。

7. 在「Search for」中如設(shè)計(jì) PCR 的引物就選擇「PCR Primers」，設(shè)計(jì)測序引物就選擇「Sequencing primers」，在「Search Type」中選擇「Pairs」。然后根據(jù)需要調(diào)整具體參數(shù)（如 PCR 產(chǎn)物長度一般為 100-300，引物長度一般為 20 左右），最后點(diǎn)擊「OK」。

8. 在新界面點(diǎn)擊「OK」，發(fā)現(xiàn)一共設(shè)計(jì)出 100 對引物。

9. 在結(jié)果中（右側(cè)區(qū)域）引物是按照評分由高到低排序的，先選擇第一對引物，引物具體信息會展示出來。左上角的 S/A 可以切換上下游引物，盡可能符合以下要求來選擇合適的引物序列：

• sense，anti-sense 最好都是 None；

• ΔG 絕對值小于 10；

• Tm 在 58 左右，上下游數(shù)值相差不超過 5；

• GC% 在 40%-60%，上下游數(shù)值相差不超過 5；

• 末端不能是 A，不能有連續(xù) 3 個相同的堿基；

• 3' 端一定不能有錯配；

10. 可以根據(jù)引物篩選原則進(jìn)行引物編輯，如選擇「Edit Primers」刪除多余堿基，然后點(diǎn)擊「Analyze」，最后點(diǎn)擊「OK」。

11. 導(dǎo)出結(jié)果：點(diǎn)擊 Edit-copy-sense primer/Anti sense primer，然后粘貼到 Excel 中。

常見問題解答 (FAQ)

Q1: 設(shè)計(jì)出的引物，評分 99 分和 95 分有多大區(qū)別？

A: 通常差別不大。評分 99 分的引物可能在某些次要參數(shù)上略優(yōu)于 95 分的。應(yīng)該同時查看它們的二級結(jié)構(gòu)和「False Priming」情況，并且根據(jù)引物篩選原則進(jìn)行判斷，如果 95 分的在這些方面表現(xiàn)更好，完全可以選 95 分的。

Q2: 「False Priming」結(jié)果怎么看？

A: 結(jié)果會顯示引物在模板上所有可能的結(jié)合位點(diǎn)，并給出一個評分。評分越高，表示錯配引發(fā)的可能性越大。應(yīng)該選擇那些在非目標(biāo)位點(diǎn)評分很低或沒有結(jié)合位點(diǎn)的引物。

Q3: 如果想在引物 5' 端加一個酶切位點(diǎn)，該怎么辦？

A: 使用手動編輯功能。先通過自動搜索找到一個核心結(jié)合區(qū)域好的引物，然后在其 5' 端直接添加上酶切位點(diǎn)序列。由于 5' 端不參與模板的特異性結(jié)合，所以這樣操作是可行的。添加后，軟件會重新計(jì)算該引物的 Tm 值等參數(shù)。

Q4: 為什么我的模板序列無法搜索到引物？

A: 請檢查：序列是否是純 DNA 序列，沒有非法字符；序列方向是否正確；搜索參數(shù)（特別是產(chǎn)物長度和 Tm 值）是否設(shè)置合理?？梢試L試放寬搜索條件（如擴(kuò)大產(chǎn)物長度范圍、Tm 值范圍）。

Q5: 如果想在質(zhì)粒序列上設(shè)計(jì)引物，需要先將其線性化嗎？

A: 不需要。Primer Premier 5 會將環(huán)狀質(zhì)粒序列視為環(huán)狀來處理。當(dāng)你設(shè)計(jì)引物時，軟件會自動考慮環(huán)狀序列的特性。當(dāng)然，你也可以在序列編輯窗口中手動將其處理為線性序列。

Q6: 如何設(shè)計(jì)用于「克隆」 或 「定點(diǎn)突變」的引物？

A: 需要在引物的 5' 端 添加額外的序列。

Q7: 二級結(jié)構(gòu)分析中的「ΔG」值代表什么？多少算可以接受？

A: ΔG（吉布斯自由能）代表結(jié)構(gòu)形成的穩(wěn)定性。核心原則：ΔG 的絕對值越?。ㄔ浇咏慊?yàn)檎担镔|(zhì)量越好。ΔG 為負(fù)值： 表示該結(jié)構(gòu)可以自發(fā)形成。絕對值越大（負(fù)得越多）： 表示結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，對 PCR 的負(fù)面影響越大。

通用接受標(biāo)準(zhǔn)：

• 發(fā)夾結(jié)構(gòu) (Hairpin): ΔG > -3.0 kcal/mol 通常可以接受。

• 二聚體 (Dimer): ΔG > -5.0 kcal/mol 通?？梢越邮?。尤其要確保 3' 端沒有穩(wěn)定的二聚體形成。

題圖來源：自制

編輯：冷漠小 z

現(xiàn)添加下方企微，發(fā)送「引物設(shè)計(jì)」， 即可獲得教程！