近期，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院與香港中文大學(xué)聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)發(fā)表于《Cell Metabolism》的研究，首次揭示了腸道細(xì)菌?Catenibacterium mitsuokai?（C. mitsuokai）在肝細(xì)胞癌（HCC）發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用及具體分子機(jī)制。通過(guò)對(duì)HCC患者糞便及腫瘤組織的微生物學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)C. mitsuokai在患者體內(nèi)顯著富集。通過(guò)多種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥C實(shí)，C. mitsuokai通過(guò)破壞腸道屏障完整性，以活菌形式易位至肝臟，并通過(guò)其表面蛋白?Gtr1/RagA?與HCC細(xì)胞上的?γ1-連環(huán)蛋白?受體結(jié)合實(shí)現(xiàn)肝臟定植。更重要的是，研究發(fā)現(xiàn)C. mitsuokai分泌的代謝產(chǎn)物?喹啉酸（QA）?可直接結(jié)合并激活HCC細(xì)胞上的?TIE2受體?，進(jìn)而啟動(dòng)下游致癌性?PI3K/AKT信號(hào)通路?，最終促進(jìn)HCC進(jìn)展。這項(xiàng)研究不僅明確了C. mitsuokai作為HCC致病菌的直接因果關(guān)系，還為理解腸道微生物通過(guò)腸-肝軸參與肝癌發(fā)生提供了新的視角。

研究背景

HCC作為全球發(fā)病率和死亡率均居高不下的惡性腫瘤，其病因復(fù)雜，除慢性乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）感染外，代謝綜合征、非酒精性脂肪性肝炎及腸道菌群失調(diào)等因素也被證實(shí)與之相關(guān)。腸-肝軸作為連接腸道與肝臟的關(guān)鍵生理通路，在肝臟疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮核心作用——腸道菌群失衡可導(dǎo)致腸道屏障功能受損（“腸漏”），使細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物通過(guò)門(mén)靜脈進(jìn)入肝臟，引發(fā)慢性炎癥和肝細(xì)胞損傷，最終促進(jìn)肝癌發(fā)生。

近年來(lái)，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)HCC患者存在顯著的腸道菌群紊亂，例如產(chǎn)脂多糖（LPS）細(xì)菌增多、益生菌減少等，但具體哪些細(xì)菌可直接驅(qū)動(dòng)肝癌發(fā)生、通過(guò)何種機(jī)制發(fā)揮作用，尚未得到明確闡釋。此前研究多聚焦于菌群代謝產(chǎn)物的間接作用，而對(duì)細(xì)菌本身是否可易位至肝臟并定植、與肝癌細(xì)胞直接相互作用的研究較為匱乏。因此，鑒定HCC相關(guān)的特異性致病菌、闡明其致病機(jī)制，對(duì)于完善HCC病因?qū)W理論、開(kāi)發(fā)新型診斷標(biāo)志物和治療策略具有重要意義。

中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院與香港中文大學(xué)聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)HCC患者和健康人群的糞便及組織樣本進(jìn)行菌群測(cè)序，篩選出差異富集的候選細(xì)菌，并通過(guò)一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)驗(yàn)證其致癌作用及分子機(jī)制，填補(bǔ)了腸道細(xì)菌直接驅(qū)動(dòng)肝癌發(fā)生的研究空白。

研究結(jié)果

?1. C.mitsuokai在HCC患者糞便和腫瘤組織中顯著富集?

為識(shí)別HCC中潛在的致病細(xì)菌，該研究對(duì)52名HCC患者的腫瘤組織和糞便，以及50名健康捐贈(zèng)者的肝組織和糞便進(jìn)行了16S rRNA測(cè)序。分析發(fā)現(xiàn)，鏈狀菌屬（Catenibacterium）在HCC患者的腫瘤組織和糞便中均顯著升高，而Catenibacterium屬中唯一已知的潛在致病菌是C. mitsuokai，一種存在于人類(lèi)腸道中的革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌。值得注意的是，在36份糞便樣本中有12份（33.3%）和38份腫瘤樣本中有5份（13.2%）檢測(cè)到C. mitsuokai，更重要的是，有5名患者（13.2%）的糞便和腫瘤樣本中同時(shí)鑒定出C. mitsuokai，這表明可能存在通過(guò)腸-肝軸的微生物易位。此外，與癌旁肝組織相比，C. mitsuokai在腫瘤組織中顯著富集。這些結(jié)果表明C. mitsuokai是HCC中一個(gè)上調(diào)的潛在致病菌。

?2. C. mitsuokai在多種HCC小鼠模型中促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)?

為探索C. mitsuokai在HCC發(fā)展中的潛在功能，該研究建立了使用小鼠HCC細(xì)胞系RIL175的HCC原位小鼠模型。與陰性對(duì)照組相比，C. mitsuokai處理的小鼠表現(xiàn)出更強(qiáng)的生物發(fā)光強(qiáng)度，并在終點(diǎn)時(shí)腫瘤重量和體積增加。為了驗(yàn)證C. mitsuokai的促瘤作用，研究人員使用了第二個(gè)原位HCC模型（小鼠Hepa1-6細(xì)胞），同樣證實(shí)C. mitsuokai灌胃加速了原位Hepa1-6腫瘤的生長(zhǎng)，表現(xiàn)為生物發(fā)光強(qiáng)度增加以及腫瘤重量和體積增大。

為了確定C. mitsuokai是否能加速代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎（MASH）相關(guān)的HCC，該研究建立了營(yíng)養(yǎng)性肝癌發(fā)生的STAM模型，發(fā)現(xiàn)C. mitsuokai灌胃的小鼠與對(duì)照組相比，血清甲胎蛋白（AFP）水平顯著升高，腫瘤數(shù)量、腫瘤體積和最大腫瘤長(zhǎng)度均顯著增加，表明C. mitsuokai也能促進(jìn)MASH相關(guān)的HCC?？傊?，C. mitsuokai可以在各種動(dòng)物模型中促進(jìn)HCC進(jìn)展。

?3. C. mitsuokai通過(guò)至肝臟促進(jìn)腫瘤發(fā)生并?破壞腸道屏障

腸道屏障完整性是阻止腸道細(xì)菌向肝臟遷移的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，C. mitsuokai灌胃可顯著增加常規(guī)小鼠和無(wú)菌小鼠的腸道通透性，表現(xiàn)為4kDa和500kDaFITC-葡聚糖的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)效率升高，門(mén)靜脈中LPS水平增加。機(jī)制上，該細(xì)菌可減少結(jié)腸黏膜中黏蛋白Mucin2的表達(dá)，破壞腸道黏液層完整性；同時(shí)下調(diào)緊密連接蛋白E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、閉合蛋白（occludin）和Claudin-3的表達(dá)，導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞間連接破壞，透射電鏡（TEM）進(jìn)一步證實(shí)了腸道上皮緊密連接和黏附連接的結(jié)構(gòu)紊亂。

通過(guò)Cy5.5-賴氨酸標(biāo)記細(xì)菌的體內(nèi)示蹤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Mitsuokai鏈狀菌灌胃后可在小鼠肝臟中檢測(cè)到熒光信號(hào)，且從肝臟組織中成功分離培養(yǎng)出該細(xì)菌，證實(shí)其能以活菌形式易位至肝臟。進(jìn)一步分析表明，Mitsuokai鏈狀菌主要破壞空腸、回腸和結(jié)腸的屏障功能，而對(duì)膽道、胃和十二指腸無(wú)顯著影響，提示其主要通過(guò)下消化道易位至肝臟。

?4. C. mitsuokai表面蛋白Gtr1/RagA通過(guò)與HCC細(xì)胞上的γ-catenin結(jié)合促進(jìn)其肝內(nèi)定植?

細(xì)菌在肝臟中的定植是其發(fā)揮致癌作用的前提。細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)顯示，C. mitsuokai對(duì)肝癌細(xì)胞（PLC5、Huh7）的黏附能力顯著高于正常肝細(xì)胞（MIHA），TEM觀察到細(xì)菌與肝癌細(xì)胞間形成明確的病原體-宿主相互作用界面。通過(guò)蛋白質(zhì)譜分析篩選出C. mitsuokai的表面蛋白Gtr1/RagA，GST下拉實(shí)驗(yàn)和表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該蛋白可與肝癌細(xì)胞表面的γ-連環(huán)蛋白（γ-catenin）直接結(jié)合，結(jié)合親和力達(dá)32.4nM，分子對(duì)接分析顯示二者具有良好的結(jié)合構(gòu)象。

功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，通過(guò)sgRNA敲低肝癌細(xì)胞中的γ-catenin后，C. mitsuokai對(duì)肝癌細(xì)胞的黏附能力顯著降低，證實(shí)Gtr1/RagA-γ-catenin相互作用是該細(xì)菌在肝內(nèi)定植的關(guān)鍵機(jī)制。

?5. C. mitsuokai分泌QA激活 TIE2/PI3K/AKT 通路

為明確C. mitsuokai發(fā)揮致癌作用的效應(yīng)分子，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)細(xì)菌條件培養(yǎng)基（CM）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其對(duì)肝癌細(xì)胞的促增殖作用可通過(guò)Transwell膜（物理隔離細(xì)菌與細(xì)胞）傳遞，且加熱或蛋白酶K處理后仍保留活性，提示效應(yīng)分子為非蛋白類(lèi)小分子。通過(guò)非靶向代謝組學(xué)分析，篩選出在細(xì)菌CM、感染細(xì)菌的小鼠腫瘤組織和糞便中均顯著富集的代謝產(chǎn)物——QA。

體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，QA可濃度依賴性地促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和集落形成，加速細(xì)胞周期G1-S期轉(zhuǎn)換，抑制凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。機(jī)制研究表明，QA可與肝癌細(xì)胞表面的TIE2受體結(jié)合，激活下游PI3K/AKT信號(hào)通路，表現(xiàn)為p-TIE2、p-PI3K和p-AKT蛋白水平顯著升高。通過(guò)sgRNA敲低TIE2或使用TIE2抑制劑，可完全阻斷QA和C. mitsuokai 對(duì)肝癌細(xì)胞的促增殖作用及PI3K/AKT通路激活。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，在Hepa1-6細(xì)胞原位移植模型中，TIE2抑制劑可顯著逆轉(zhuǎn)C. mitsuokai的促腫瘤作用，降低腫瘤體積和重量，同時(shí)抑制腫瘤組織中PI3K/AKT通路激活，證實(shí)QA-TIE2-PI3K/AKT軸是該細(xì)菌致癌的核心機(jī)制。

研究結(jié)論

該項(xiàng)研究確定了C. mitsuokai是富集于HCC的一種致病菌。C. mitsuokai破壞腸道屏障，并以Gtr1/RagA-γ-連環(huán)蛋白作為活細(xì)菌定植HCC細(xì)胞。C. mitsuokai衍生的代謝物QA與酪氨酸激酶受體TIE2結(jié)合驅(qū)動(dòng)下游PI3K/AKT通路，從而促進(jìn)HCC發(fā)展。

這項(xiàng)工作首次證明了C. mitsuokai通過(guò)破壞腸道屏障、結(jié)腸化HCC細(xì)胞和分泌QA激活下游TIE2/PI3K/AKT通路，從而促進(jìn)HCC進(jìn)展。C. mitsuokai誘導(dǎo)腸道屏障功能失常，使其能夠以活菌形式易位至肝臟，并在其中實(shí)現(xiàn)活菌定植。更重要的是，C. mitsuokai分泌的QA作為致癌代謝物激活TIE2/PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)，為理解HCC中腸道微生物的作用機(jī)制提供了重要見(jiàn)解。未來(lái)的研究將進(jìn)一步驗(yàn)證C. mitsuokai在不同人群中的分布特征，并探索靶向TIE2通路對(duì)HCC患者的臨床治療價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

Zhang Y, Liu W, Wong CC, et al. Catenibacteriummitsuokai promotes hepatocellular carcinogenesis by binding to hepatocytes and generating quinolinic acid. Cell Metab. 2025 Oct 7;37(10):1998-2013.e7.

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