研究背景

肝內膽管細胞癌（iCCA）是一種侵襲性很強的膽道惡性腫瘤，預后極差，主要原因在于診斷較晚且對治療存在耐藥性。iCCA的顯著特征是具有豐富的腫瘤微環(huán)境（TME），其中富含癌相關成纖維細胞（CAF）；CAF可產(chǎn)生大量膠原蛋白和彈性纖維，并沉積于細胞外基質（ECM）中，這些成分會促進腫瘤進展并增強其化療耐藥性。對于大多數(shù)無法接受手術的iCCA患者，化療聯(lián)合免疫方案已于近期批準，成為新的標準治療方案。盡管免疫治療的應用標志著多年來該領域的首次突破，但聯(lián)合方案在相當一部分患者中仍顯示出療效有限的問題。因此，尋找新方法以增強這些無應答患者的免疫反應已成為關鍵。

在此背景下，具有強效免疫抑制活性的轉化生長因子-β（TGF-β）已成為極具吸引力的靶點，針對TGF-β抑制劑的研究也備受關注。然而，近期一項TGF-β抑制劑聯(lián)合化療的II/III期臨床研究結果未達預期且已終止，這表明尚存在未知機制影響了TGF-β作為CCA治療靶點的應用。重要的是，盡管TGF-β抑制劑已用于CCA臨床試驗，但目前尚無證據(jù)支持其在CCA臨床前模型中具有療效。

TGF-β可激活復雜的信號通路，調控細胞增殖、遷移、死亡等多種細胞過程，TGF-β信號失調在癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但由于其兼具腫瘤抑制和促進癌變的雙重能力，將其作為治療靶點仍面臨挑戰(zhàn)。最有效的策略應是在保留TGF-β抑癌效應的同時，阻斷其促腫瘤作用。在此背景下，一種頗具前景的策略是靶向TGF-β受體下游，僅介導其促腫瘤功能的胞內蛋白。在這些候選蛋白中，NADPH氧化酶家族成員NOX4是腫瘤細胞及腫瘤微環(huán)境中TGF-β信號通路的下游介質，也是活性氧（ROS）的關鍵來源。目前關于NOX4在iCCA腫瘤細胞及腫瘤微環(huán)境中的功能與治療潛力，仍有待闡明。

研究設計

培養(yǎng)CCA類器官并檢測不同藥物的有效性。類器官是一種三維細胞培養(yǎng)模型，能模擬體內器官的結構和功能，在腫瘤研究中可更真實反映腫瘤微環(huán)境和藥物響應。本研究中，類器官源自患者來源異種移植瘤（PDX）。

培養(yǎng)細胞株，包括人iCCA細胞（HuCCT1、SG231等）、小鼠iCCA細胞（SB1）、肝星狀細胞（LX2-HSC、hTERT-HSC等），并在不同基因編輯條件下進行集落形成實驗和球體形成實驗。

通過RNA測序、逆轉錄定量PCR（RT-qPCR）和免疫印跡與免疫組化分析基因組、轉錄組、蛋白組特征；在動物模型中探索不同干預條件下的腫瘤數(shù)目、體積變化，并通過免疫組化檢測Ki67等標志物。

研究結果

一、TGF-β信號通路在人類和小鼠CCA樣本中均被激活

在人類隊列（IDIBELL、TCGA、TIGER-LC）和小鼠iCCA模型中，iCCA組織中TGF-β配體（TGFB1、TGFB2）和TGF-β受體1的mRNA表達水平均顯著高于非腫瘤組織。在小鼠模型和人類TCGA隊列中，TGF-β配體3和TGF-β受體2的表達水平也有所升高，提示iCCA中TGF-β信號通路被激活。與非腫瘤肝組織相比，人類和小鼠iCCA組織中SMAD2蛋白的磷酸化水平均顯著升高，TGF-β信號通路的激活還導致下游基因表達水平上調。

二、TGF-β抑制劑在體外促進CCA腫瘤細胞生長

體外實驗結果顯示，TGF-β1顯著降低5種細胞系（KKU-213A、KKU-213C、HuCCT1、HuH28、RBE）的細胞活力；而另外2種細胞系（CCLP1、SG231）未出現(xiàn)明顯變化。在經(jīng)TGF-β1處理后活力降低的5種細胞系中，經(jīng)典通路相關分子SMAD2/SMAD3的磷酸化水平升高；而在活力未降低的2種細胞系中，SMAD2和SMAD3的磷酸化水平均未升高。進一步分析發(fā)現(xiàn)，CCLP1細胞中無SMAD3表達，SG231細胞中SMAD7（TGF-β信號通路的負調控因子）表達水平極高，這也解釋了為何這兩種細胞系對TGF-β無應答。集落形成實驗和球體形成實驗結果顯示，TGF-β1可顯著減少HuCCT1和RBE細胞形成的集落數(shù)量及球狀體大小，而TGF-β抑制劑則可顯著增加集落數(shù)量及球狀體大小。RNA測序結果顯示，iCCA細胞在TGF-β和TGF-β抑制劑干預下，轉錄組表達呈現(xiàn)相反的作用。

基因富集分析顯示，TGF-β1可上調與ECM調控及細胞遷移相關的通路，同時下調與DNA合成及細胞周期進程相關的通路。在由iCCA轉移灶活檢樣本建立的患者來源異種移植瘤類器官（PDXO）中，4個類器官模型中有3個經(jīng)TGF-β1處理后活力顯著下降，經(jīng)TGF-β抑制劑處理后活力顯著上升。唯一未出現(xiàn)活力變化的類器官缺乏功能性的TGF-β經(jīng)典信號通路（無SMAD3磷酸化），這表明，在TGF-β信號通路完整的iCCA細胞系中，TGF-β均可抑制細胞生長；而在TGF-β信號通路受損的細胞系中，TGF-β則無此作用。因此，在iCCA中，TGF-β對腫瘤細胞的作用以抑制為主。由此可見，使用靶向TGF-β受體的抑制劑可能會通過誘導腫瘤細胞增殖而產(chǎn)生適得其反的效果。

三、NOX4在iCCA中過表達，且僅表達于CAF

對人類數(shù)據(jù)集的分析顯示，與周圍非腫瘤肝組織相比，人類iCCA中NOX4表達升高。單細胞RNA測序數(shù)據(jù)分析表明，NOX4表達主要局限于肌成纖維細胞樣CAF。相應地，iCCA患者中NOX4的表達與CAF標志物的表達相關。提示NOX4的表達可能在癌變過程中參與CAF的活化。事實上，與非腫瘤肝組織或肝細胞癌（HCC）細胞系相比，iCCA細胞系中不存在NOX4表達，而成纖維細胞系經(jīng)TGF-β1處理以刺激其活化后NOX4表達升高，同時α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和Ⅰ型膠原蛋白的表達也增加。

四、同時敲低NOX4和NOX1是抑制人類肝成纖維細胞轉分化的必要條件

令人驚訝的是，野生型和NOX4基因敲除小鼠的腫瘤大小和Krt19、α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白的表達水平上是相同。TGF-β1能夠增加對照細胞中的ROS水平，NOX4基因敲除細胞的基礎ROS水平已升高，且經(jīng)TGF-β1處理后無變化。這一結果使我們推測，可能存在一種補償機制，使ROS水平升高到足以支持TGF-β1誘導的成纖維細胞轉分化。進一步的研究結果表明，小干擾RNA（siRNA）介導的NOX1下調顯著降低了NOX1蛋白水平，消除了TGF-β1誘導的α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白升高，并降低了ROS水平，驗證了這一補償機制。

為進一步闡明NOX4和/或NOX1對TGF-β誘導的成纖維細胞轉分化的特異性作用，在WT細胞中進行了額外的siRNA研究。值得注意的是，僅同時下調NOX4和NOX1，才能抑制hTERT-HSC和LX2-HSC細胞中TGF-β1誘導的α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白升高。免疫組織化學分析證實，NOX4和NOX1蛋白在相同的間質細胞中表達，且只有NOX4和NOX1均低表達的患者，其生存率優(yōu)于其中一種或兩種NOX高表達的患者，這表明NOX4/NOX1組合在iCCA病理生理過程中發(fā)揮重要作用。

五、雙重抑制NOX4/NOX1可損害HSC和CAF功能，并在體外抑制iCCA生長

NOX4/NOX1抑制劑和TGF-β抑制劑均能抑制TGF-β1誘導的α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白表達升高。RNA測序分析顯示，NOX4/NOX1抑制劑干預的HSC細胞系基因數(shù)量多于TGF-β抑制劑（1390個 vs. 325個）?；蚣患治鲲@示，NOX4/NOX1抑制劑能夠抑制許多與肌成纖維細胞活化以及ECM組織相關的信號通路，而TGF-β抑制劑主要調控與ECM代謝和整合素相互作用相關的通路。并且NOX4/NOX1抑制劑和TGF-β抑制劑均能降低CAF特征的富集度，尤其是在hTERT-HSC和HSC-GFP細胞中，這表明這些抑制劑具有抑制肌成纖維細胞樣CAF表型的潛力。

在惡性細胞和HSC-GFP形成的混合球體中，NOX4/NOX1抑制劑對僅由腫瘤細胞形成的球體或與內皮細胞或巨噬細胞聯(lián)合形成的球體大小無影響，但顯著降低了混合球體的生長，表明NOX4/NOX1抑制劑對肝肌成纖維細胞（唯一表達NOX4/NOX1的細胞）具有特異性。然而，TGF-β抑制劑增加了混合球體的大小，這表明盡管其能夠抑制成纖維細胞功能，但TGF-β抑制劑促進腫瘤細胞生長的作用占主導地位。另外，在不同的CAF細胞群中，無論是否存在TGF-β1，NOX4/NOX1抑制劑均能降低CAF標志物的蛋白水平。最后，NOX4/NOX1抑制劑還能減少由iCCA細胞和CAF形成的混合球體的腫瘤生長，而對僅由腫瘤細胞形成的球體無任何影響。總之，這些數(shù)據(jù)表明，NOX4/NOX1抑制劑可能通過靶向CAF功能，成為一種有前景的腫瘤生長靶向策略。

六、雙重抑制NOX4/NOX1可減少體內iCCA腫瘤負荷，而TGF-β抑制劑則無此效果

在PDX模型中進行的研究表明，TGF-β抑制劑增加了腫瘤生長，且僅降低凋亡，但對細胞增殖無影響；而NOX4/NOX1抑制劑則強效抑制了腫瘤生長、減少細胞增殖并增加凋亡，且減少了CAF的數(shù)量和膠原蛋白沉積。

iCCA小鼠模型中進行的研究表明，NOX4/NOX1抑制劑減少了腫瘤結節(jié)而TGF-β抑制劑增加了腫瘤結節(jié)。免疫組織化學定量顯示，NOX4/NOX1抑制劑組中Ki67陽性細胞的百分比降低，而TGF-β抑制劑處理的腫瘤則觀察到相反的效果。對TME的進一步染色顯示NOX4/NOX1抑制劑組CAF的染色強度較低，膠原蛋白沉積減少。在該動物模型中對CD4+T細胞的分析顯示，TGF-β抑制劑增加了CD4+T細胞的募集，但這些細胞仍被排除在腫瘤的外環(huán)，而NOX4/NOX1抑制劑處理則增加了CD4+T細胞在腫瘤內的存在。此外，NOX4/NOX1抑制劑處理還降低了程序性死亡配體1（PD-L1）的表達。RNA測序分析顯示，具有NOX4/NOX1抑制劑富集基因特征的患者表現(xiàn)出更長的生存期、PD-L1編碼基因表達水平降低以及活化的CD4+T細胞浸潤增加。

挑戰(zhàn)與展望

研究結論

總之，研究結果表明，TGF-β信號通路對iCCA腫瘤細胞具有抑制作用，這對TGF-β受體抑制劑的應用提出了挑戰(zhàn)，而抑制TGF-β信號通路的下游效應分子NOX4/NOX1，可通過調節(jié)TME，特異性損害CAF的功能，并抑制CCA的生長。未來仍需進一步評估NOX4/NOX1抑制劑與現(xiàn)有療法的聯(lián)合應用，以充分挖掘其潛力。

參考文獻：

1. Amengual J, et al. NADPH oxidase 1/4 dual inhibition impairs transforming growth factor-beta protumorigenic effects in cholangiocarcinoma cancer-associated fibroblasts. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):257.

審批編號：CN-172844

有效期至：2026/11/24

本材料由阿斯利康提供，僅供醫(yī)療衛(wèi)生專業(yè)人士參考

撰寫：Arrival

審校：Arrival

排版：Aurora

執(zhí)行：Zelda

本平臺旨在為醫(yī)療衛(wèi)生專業(yè)人士傳遞更多醫(yī)學信息。本平臺發(fā)布的內容，不能以任何方式取代專業(yè)的醫(yī)療指導，也不應被視為診療建議。如該等信息被用于了解醫(yī)學信息以外的目的，本平臺不承擔相關責任。本平臺對發(fā)布的內容，并不代表同意其描述和觀點。若涉及版權問題，煩請權利人與我們聯(lián)系，我們將盡快處理。