科學(xué)家按下基因進(jìn)化的“超級(jí)加速鍵”，過(guò)去自然界中需要數(shù)萬(wàn)年甚至更久的基因突變和進(jìn)化過(guò)程，現(xiàn)在只需要 1 天就能完成了。

最近，清華大學(xué)陳國(guó)強(qiáng)教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種突破性的定向進(jìn)化技術(shù)——“正交轉(zhuǎn)錄突變系統(tǒng)”（orthogonal transcription mutation system）。該系統(tǒng)能夠加速對(duì)目標(biāo)基因的進(jìn)化過(guò)程，具有突變效率高、特異性高、突變范圍廣、宿主兼容性強(qiáng)和使用簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。

值得關(guān)注的是，該系統(tǒng)在非模式生物中突變率提升超過(guò) 150 萬(wàn)倍。研究人員應(yīng)用該系統(tǒng)在單日誘變周期內(nèi)快速進(jìn)化了熒光蛋白、色素蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞分裂相關(guān)蛋白、全局轉(zhuǎn)錄因子及 LysE 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。這意味著，原本需要數(shù)周甚至數(shù)月迭代進(jìn)化才能獲得的理想效果，現(xiàn)在僅需 1 天即可實(shí)現(xiàn)。

圖丨邵明威（來(lái)源：邵明威）

通過(guò)將脫氨酶與噬菌體 RNA 聚合酶融合，該系統(tǒng)能夠在目標(biāo)基因中均勻引入 C：G 到 T：A 和 A：T 到 G：C 的突變，同時(shí)保持較低的脫靶效應(yīng)。研究團(tuán)隊(duì)對(duì)該工具的特異性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)它能夠針對(duì)特定的目標(biāo)基因產(chǎn)生高頻突變，對(duì)其他基因的干擾很小，從而保證了高特異性。

多個(gè)基因測(cè)試結(jié)果顯示，該系統(tǒng)在超過(guò)幾千個(gè)堿基對(duì)的長(zhǎng)度上也能產(chǎn)生大量突變，展現(xiàn)出廣泛的突變范圍。此外，該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了兼容不同生物體系——不僅適用于大腸桿菌為代表的模式生物，也適用于以嗜鹽單胞菌 Halomonas bluephagenesis 為代表的極端微生物。

在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，該系統(tǒng)為蛋白質(zhì)功能研究提供了全新的工具。它不僅能快速鑒定關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)、解析催化機(jī)制，更重要的是可以建立蛋白質(zhì)進(jìn)化過(guò)程中序列與功能之間的映射關(guān)系，從而加速對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)化機(jī)制的理解。

在工業(yè)應(yīng)用方面，該系統(tǒng)展現(xiàn)出廣闊的前景。首先，在藥物研發(fā)領(lǐng)域，可對(duì)制藥相關(guān)蛋白、酶或抗體進(jìn)行高效突變，既能加速藥物生產(chǎn)流程，又能優(yōu)化抗體功能。其次，在綠色生物制造方面，通過(guò)改造微生物對(duì)纖維素水解液、乙酸等非常規(guī)碳源的利用基因，可顯著提高資源利用效率。更重要的是，該系統(tǒng)能大幅提升工業(yè)酶的催化活性，從而優(yōu)化整個(gè)生產(chǎn)流程的效率。

目前，該團(tuán)隊(duì)已與合成生物學(xué)公司微構(gòu)工場(chǎng)合作，利用正交轉(zhuǎn)錄突變系統(tǒng)對(duì)聚羥基脂肪酸酯（PHA，Polyhydroxyalkanoates）合成的關(guān)鍵基因進(jìn)行突變和進(jìn)化，旨在通過(guò)提高 PHA 的合成效率，為 PHA 工業(yè)放大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

審稿人對(duì)該研究評(píng)價(jià)稱：“總體而言，這項(xiàng)研究基于 MmP1、K1F 和 VP4 RNA 聚合酶建立了正交轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的連續(xù)進(jìn)化系統(tǒng)。該研究設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)、方法可靠，為構(gòu)建高效生物催化系統(tǒng)提供了切實(shí)可行的解決方案?！?/p>

近日，相關(guān)論文以《一種用于加速體內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)化的正交轉(zhuǎn)錄突變系統(tǒng)，可產(chǎn)生所有轉(zhuǎn)換突變》（An orthogonal transcription mutation system generating all transition mutations for accelerated protein evolution in vivo）為題發(fā)表在Nature Communications[1]。清華大學(xué)博士生邵明威是第一作者，陳國(guó)強(qiáng)教授擔(dān)任通訊作者。

圖丨相關(guān)論文（來(lái)源：Nature Communications）

理想的“五合一”蛋白進(jìn)化系統(tǒng)：效率高、特異性高、突變范圍廣、宿主兼容性強(qiáng)和使用簡(jiǎn)便

蛋白質(zhì)的進(jìn)化和優(yōu)化在生物制藥、工業(yè)生物技術(shù)和合成生物學(xué)等領(lǐng)域具有重要意義。然而，傳統(tǒng)蛋白進(jìn)化方法在效率、宿主兼容性或突變范圍大小等方面存在局限性，特別對(duì)于鹽單胞菌這種非模式生物而言，目前仍然缺乏高效優(yōu)化蛋白質(zhì)功能的工具。

首先，體外突變方法（如易錯(cuò) PCR 等）雖然能夠構(gòu)建突變體文庫(kù)，但整個(gè)過(guò)程周期較長(zhǎng)，通常需要數(shù)周甚至數(shù)個(gè)月才能完成文庫(kù)構(gòu)建和宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化。此外，這類方法嚴(yán)重依賴轉(zhuǎn)化效率，尤其是當(dāng)目標(biāo) DNA 片段較大時(shí)，轉(zhuǎn)化效率會(huì)大幅下降，這會(huì)導(dǎo)致最終導(dǎo)入宿主細(xì)胞的突變體數(shù)量有限，從而降低篩選到目標(biāo)突變體的概率。

其次，現(xiàn)有的體內(nèi)進(jìn)化方法雖然避免了體外轉(zhuǎn)化的限制，但仍存在諸多不足。例如，美國(guó)哈佛大學(xué)劉如謙教授實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的噬菌體輔助連續(xù)進(jìn)化系統(tǒng)（PACE）雖然高效，但系統(tǒng)搭建復(fù)雜，且僅適用于特定蛋白質(zhì)的進(jìn)化。

類似地，基于正交 DNA 復(fù)制的突變系統(tǒng)通常局限于特定宿主，難以遷移至新其他宿主中；而基于 T7 RNA 聚合酶的突變工具在非模式生物（如假單胞菌、嗜鹽單胞菌）中效率較低，甚至完全失效。此外，基于 CRISPR-Cas 的突變系統(tǒng)通常僅能在特定位點(diǎn)引入突變，無(wú)法覆蓋整個(gè)基因或基因簇。

基于這些挑戰(zhàn)，研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，一個(gè)理想的蛋白進(jìn)化系統(tǒng)應(yīng)具備以下特點(diǎn)：首先，突變效率高，能夠在短時(shí)間內(nèi)完成突變過(guò)程；其次，突變特異性高，僅針對(duì)目標(biāo)基因產(chǎn)生突變，不影響其他基因的功能；第三，突變范圍廣，能夠覆蓋整個(gè)目標(biāo)基因或基因簇，而不僅僅局限于單個(gè)堿基；第四，宿主兼容性強(qiáng)，能夠在不同宿主細(xì)胞（包括模式和非模式生物）中使用，具有廣泛的兼容性；最后，使用簡(jiǎn)便，無(wú)需復(fù)雜的儀器設(shè)備即可完成突變進(jìn)化。

核心機(jī)制：脫氨酶融合噬菌體 RNA 聚合酶實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)突變

正交轉(zhuǎn)錄突變系統(tǒng)的核心在于，將 MmP1、K1F 和 VP4 這三種本身具有廣宿主兼容性的噬菌體 RNA 聚合酶與脫氨酶進(jìn)行融合。

這一巧妙設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)關(guān)鍵功能的協(xié)同作用：RNA 聚合酶主要負(fù)責(zé)識(shí)別對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子，進(jìn)而啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，此時(shí)雙鏈 DNA 會(huì)解旋成單鏈；脫氨酶可以對(duì)暴露的單鏈 DNA 區(qū)域進(jìn)行突變，通過(guò)組合不同類型的脫氨酶可實(shí)現(xiàn) C：G 到 T：A 和 A：T 到 G：C 兩種堿基突變。

實(shí)驗(yàn)顯示，產(chǎn)生 C：G 到 T：A 突變的 pMT2-MmP1-W 突變效率比對(duì)照組提高 150 萬(wàn)倍，而 pMT23opt-MmP1 可同時(shí)引入 C：G 到 T：A 和 A：T 到 G：C 突變，日均突變率達(dá) 2.64 次/千堿基，遠(yuǎn)超此前技術(shù)。

邵明威對(duì) DeepTech 解釋說(shuō)道：“該系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在精準(zhǔn)可控，當(dāng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程終止時(shí)突變也會(huì)同步停止，從而保證了對(duì)特定基因和區(qū)域的突變。并且，這種基于噬菌體 RNA 聚合酶與啟動(dòng)子特異性識(shí)別的機(jī)制，賦予了系統(tǒng)極高的突變特異性。”

（來(lái)源：Nature Communications）

在構(gòu)建雙類型突變系統(tǒng)的過(guò)程中，研究團(tuán)隊(duì)采用了三種不同的設(shè)計(jì)策略。首先，針對(duì)兩種功能不同的脫氨酶（胞嘧啶脫氨酶可產(chǎn)生 C：G 到 T：A 類型的突變；腺嘌呤脫氨酶則能產(chǎn)生 A：T 到 G：C 類型的突變），他們?cè)O(shè)計(jì)了兩種融合順序相反的突變系統(tǒng)：一種采用“胞嘧啶脫氨酶-腺嘌呤脫氨酶-RNA 聚合酶”的串聯(lián)結(jié)構(gòu)，另一種則采用“腺嘌呤脫氨酶-胞嘧啶脫氨酶-RNA 聚合酶”相反順序。

此外，他們還開發(fā)了第三種系統(tǒng)——在單個(gè)質(zhì)粒中同時(shí)表達(dá)“腺嘌呤脫氨酶-RNA 聚合酶”和“胞嘧啶脫氨酶-RNA 聚合酶”突變?cè)?/p>

“在構(gòu)建第三種突變系統(tǒng)的過(guò)程中，我們對(duì)其中一個(gè) RNA 聚合酶的序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，這樣能夠有效避免因 RNA 聚合酶基因序列高度相似而導(dǎo)致的同源重組問(wèn)題?！鄙勖魍f(shuō)。

（來(lái)源：Nature Communications）

這項(xiàng)歷時(shí)近三年的研究過(guò)程充滿了挑戰(zhàn)。都說(shuō)“萬(wàn)事開頭難”，研究初期在構(gòu)建突變檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)就遇到了長(zhǎng)達(dá)半年的瓶頸期。該團(tuán)隊(duì)最初嘗試在嗜鹽單胞菌中將脫氨酶與 RNA 聚合酶融合來(lái)驗(yàn)證概念可行性，但如何準(zhǔn)確評(píng)估突變效率成為關(guān)鍵難題。

常規(guī)的抗生素抗性基因檢測(cè)方法在實(shí)驗(yàn)使用的非模式菌株（嗜鹽單胞菌）中面臨重大挑戰(zhàn)——該菌株天然對(duì)卡那霉素、氨芐霉素和鏈霉素等多種抗生素具有抗性。

為此，研究人員在前期構(gòu)建突變檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，篩選了大量候選抗生素與抗性基因。邵明威表示：“經(jīng)過(guò)不斷篩選，與陳國(guó)強(qiáng)老師交流以及和實(shí)驗(yàn)室其他同學(xué)討論，我們最終發(fā)現(xiàn)基于紅霉素抗性基因是有效的檢測(cè)方案。”

（來(lái)源：Nature Communications）

研究過(guò)程中遇到的另外一個(gè)難題是突變?cè)谀繕?biāo)基因上分布不均勻。在系統(tǒng)優(yōu)化階段，研究人員發(fā)現(xiàn)突變存在明顯的區(qū)域偏好性，主要集中在啟動(dòng)子附近區(qū)域，這種不均勻分布嚴(yán)重影響了蛋白質(zhì)的全面優(yōu)化。

通過(guò)大量文獻(xiàn)調(diào)研和深入思考，邵明威嘗試通過(guò)在目標(biāo)基因的上下游同時(shí)插入招募突變系統(tǒng)的啟動(dòng)子。這一改進(jìn)使突變數(shù)目顯著增加，且分布更加均勻?！霸诩夹g(shù)瓶頸期持續(xù)探索后，突然找到解決方案的那一刻，有種豁然開朗的感覺(jué)?！鄙勖魍貞浀馈?/p>

計(jì)劃 1 年內(nèi)落地產(chǎn)業(yè)化，推動(dòng)綠色生物制造

陳國(guó)強(qiáng)教授是中國(guó)首位獲得國(guó)際代謝工程獎(jiǎng)的合成生物學(xué)專家，其團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期致力于合成生物學(xué)和微生物代謝工程研究，尤其專注于利用合成生物學(xué)技術(shù)對(duì)極端微生物鹽單胞菌（Halomonas）進(jìn)行系統(tǒng)性遺傳改造。

鹽單胞菌作為一類從高鹽環(huán)境（2.5M NaCl）中分離鑒定的特殊微生物，具有耐鹽堿、抗污染等獨(dú)特的極端環(huán)境適應(yīng)特性?；谶@些特性，該團(tuán)隊(duì)在國(guó)際上創(chuàng)新性地提出了“以鹽單胞菌為底盤細(xì)胞的下一代工業(yè)生物技術(shù)”發(fā)展戰(zhàn)略。

該技術(shù)路線包含三個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)——開發(fā)高效的蛋白質(zhì)定向進(jìn)化工具，重構(gòu)代謝網(wǎng)絡(luò)以及優(yōu)化發(fā)酵控制參數(shù)，最終目標(biāo)是實(shí)現(xiàn) PHA、四氫嘧啶、重組蛋白等高附加值生物產(chǎn)品的規(guī)?；a(chǎn)。

在具體實(shí)施過(guò)程中，他們特別重視關(guān)鍵功能基因的定向進(jìn)化，例如通過(guò)對(duì) PHA 合成酶基因簇的系統(tǒng)性優(yōu)化，顯著提升其催化效率和底物利用范圍等核心性能指標(biāo)，從而大幅提高了目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量和品質(zhì)。

嗜鹽菌作為“下一代工業(yè)生物技術(shù)”核心底盤，可在開放無(wú)滅菌條件下低成本生產(chǎn) PHA、四氫嘧啶等高值產(chǎn)物，但此前缺乏高效的蛋白質(zhì)定向進(jìn)化工具。團(tuán)隊(duì)在本次研究中開發(fā)的正交轉(zhuǎn)錄突變系統(tǒng)具有顯著的模塊化和可擴(kuò)展性特征。該系統(tǒng)可靈活應(yīng)用于任何目標(biāo)基因的改造。舉例來(lái)說(shuō)，在生物制造過(guò)程中，若發(fā)現(xiàn)某個(gè)關(guān)鍵酶的活性不足導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)量受限，即可利用該系統(tǒng)對(duì)相關(guān)酶進(jìn)行快速突變優(yōu)化。

圖 | 微構(gòu)工場(chǎng)透明發(fā)酵罐（來(lái)源：微構(gòu)工場(chǎng)）

在技術(shù)轉(zhuǎn)化方面，陳國(guó)強(qiáng)此前還聯(lián)合發(fā)起成立了合成生物學(xué)企業(yè)微構(gòu)工場(chǎng)。該公司是一家在生物制造前沿領(lǐng)域極具創(chuàng)新影響力的科技公司，通過(guò)嗜鹽微生物的改造和工程化應(yīng)用，進(jìn)行綠色高分子生物材料 PHA 的研發(fā)和制造。

此次關(guān)于正交轉(zhuǎn)錄突變系統(tǒng)的研究成果，與 PHA 材料密切相關(guān)。該系統(tǒng)可高效優(yōu)化參與 PHA 合成的關(guān)鍵酶，提升其活性和穩(wěn)定性，從而提高 PHA 的產(chǎn)量和質(zhì)量。

同時(shí)，通過(guò)改造生產(chǎn) PHA 的微生物菌株，增強(qiáng)其合成能力，有望降低成本并拓展 PHA 在生物可降解塑料和醫(yī)用材料等領(lǐng)域的應(yīng)用，為 PHA 材料的高效生產(chǎn)提供了有力支持。

目前，實(shí)驗(yàn)室正與微構(gòu)工場(chǎng)開展深度合作，預(yù)計(jì)經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模驗(yàn)證后，計(jì)劃在 1 年內(nèi)推進(jìn)研究成果的工業(yè)化放大。得益于微構(gòu)工場(chǎng)完備的發(fā)酵設(shè)備體系（從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的幾升發(fā)酵罐到工業(yè)化生產(chǎn)的數(shù)百乃至上千升發(fā)酵系統(tǒng)），實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的高活性蛋白質(zhì)突變體或優(yōu)化菌株可直接進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)驗(yàn)證，實(shí)現(xiàn)從基礎(chǔ)研究到產(chǎn)業(yè)應(yīng)用的快速轉(zhuǎn)化。

圖 | 微構(gòu)工場(chǎng)百升發(fā)酵罐（來(lái)源：微構(gòu)工場(chǎng)）

值得注意的是，在微生物突變篩選的初期階段，并不需要進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵，僅需幾十毫升的培養(yǎng)瓶即可開展工作。由于細(xì)菌培養(yǎng)密度極高（>10? cells/mL），幾毫升搖瓶培養(yǎng)就能構(gòu)建大規(guī)模的突變體文庫(kù)并進(jìn)行高效篩選，待獲得理想突變體后再進(jìn)行放大驗(yàn)證。

針對(duì)放大過(guò)程中可能面臨的發(fā)酵穩(wěn)定性問(wèn)題，團(tuán)隊(duì)認(rèn)為可將優(yōu)化后的突變基因整合到細(xì)菌染色體上。這種染色體整合策略有效避免了傳統(tǒng)質(zhì)粒系統(tǒng)（依賴抗生素維持且易丟失）的缺陷，確保了工業(yè)化生產(chǎn)的穩(wěn)定性。具體操作流程包括：先將突變基因整合至染色體，再進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證和規(guī)?；a(chǎn)。

在接下來(lái)的研究中，他們計(jì)劃在技術(shù)和應(yīng)用層面同時(shí)推進(jìn)。首次，將嘗試整合其他類型的脫氨酶，來(lái)進(jìn)一步豐富突變數(shù)據(jù)庫(kù)的多樣性。其次，還將探索這套系統(tǒng)在其他宿主細(xì)胞中的兼容性和適用性。在應(yīng)用層面，研究團(tuán)隊(duì)打算利用該系統(tǒng)來(lái)加速生物制造中關(guān)鍵酶的優(yōu)化，以及推動(dòng)其他重要生物分子的生產(chǎn)。通過(guò)優(yōu)化這些關(guān)鍵酶，助力生物綠色生物經(jīng)濟(jì)的發(fā)展進(jìn)程。

參考資料：

1.Shao, M., Zhang, Z., Jin, X. et al. An orthogonal transcription mutation system generating all transition mutations for accelerated protein evolution in vivo.Nature Communications16, 6041 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-61354-4

運(yùn)營(yíng)/排版：何晨龍