近日，Plant Biotechnology Journal雜志在線發(fā)表了由石河子大學(xué)孫杰課題組及其合作團(tuán)隊(duì)撰寫的“pseudo-GhFAD2-1 is a lncRNA involved in regulating cottonseed oleic and linoleic acid ratios and seed size in ?Gossypium hirsutum”論文。該研究發(fā)現(xiàn)，源于棉花D亞基因組上GhFAD2-1的串聯(lián)重復(fù)序列pseudo-GhFAD2-1（pGhFAD2-1）因剪接位點(diǎn)的改變使得pGhFAD2-1成為無(wú)蛋白質(zhì)編碼能力的lncRNA。進(jìn)一步，對(duì)pGhFAD2-1進(jìn)行過(guò)表達(dá)、基因編輯敲除、互作蛋白鑒定及染色體可及性分析等，揭示了pGhFAD2-1在調(diào)控棉籽脂肪酸組分合成、籽粒大小等方面的新功能。研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道的這一棉花lncRNA，有助于深入認(rèn)識(shí)異源多倍體的基因表達(dá)與調(diào)控，也為棉籽油的品質(zhì)及種子大小的遺傳改良提供了新的靶點(diǎn)和途徑。

棉花（G. hirsutum）不僅是最重要的纖維作物，也是食用油的重要來(lái)源。在高等植物中，Δ12-脂肪酸脫氫酶（Δ12-fatty acid desaturase）催化單不飽和的油酸（C18:1）向多不飽和的亞油酸（C18:2）轉(zhuǎn)化。陸地棉具有復(fù)雜的異源四倍體基因組（AADD; 2n=4x=52），GhFAD2-1（位于A基因組第13號(hào)染色體的GhFAD2-1A和D基因組第13號(hào)染色體的GhFAD2-1D）在棉籽發(fā)育過(guò)程中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，是控制種子中C18:1向C18:2轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵基因，決定了棉籽中C18:2的含量。在D基因組還存在一個(gè)獨(dú)特的，且與GhFAD2-1D緊密連鎖，且高度同源的序列。將其命名為pseudo-GhFAD2-1（pGhFAD2-1）。序列分析發(fā)現(xiàn)，pGhFAD2-1是GhFAD2-1D的串聯(lián)重復(fù)拷貝，且在重復(fù)事件發(fā)生過(guò)程中，一段 1, 221 bp 的序列插入到復(fù)制的 GhFAD2-1D 的編碼序列中，導(dǎo)致其部分編碼序列（227 bp）丟失。插入的部分序列（995 bp）、GhFAD2-1D的部分編碼序列以及 GhFAD2-1D 的 5' 端和 3' 端部分序列共同形成了新的轉(zhuǎn)錄序列（1476 bp）。但剪接事件使得這個(gè) 1476 nt 的全長(zhǎng) cDNA 不再能夠編碼脂肪酸去飽和酶，僅具有一個(gè) 318 bp 的開(kāi)放閱讀框。全文主要研究結(jié)果如下：

1. pGhFAD2-1參與調(diào)控了脂肪酸成分的合成

通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化“YZ-1”，分別獲得pGhFAD2-11過(guò)表達(dá)（OE）及敲除株系（KO）。與CK相比，KO株系中GhFAD2-1表達(dá)顯著上調(diào)；而在OE株系中，其表達(dá)顯著下調(diào)。在OE中，C18:1含量從20 DPA至60 DPA持續(xù)上升，成熟種子中達(dá)到21.36%，分別較CK和KO提高12.50%和29.38%。而OE的C18:2含量始終低于CK和KO。KO和CK成熟種子中C18:2的相對(duì)百分比分別為52.58%和50.86%，較OE的49.18%分別提高6.91%和3.41%。這表明OE中C18:1向C18:2的轉(zhuǎn)化受到抑制，導(dǎo)致C18:1更多積累；而KO則呈現(xiàn)相反趨勢(shì)，表明pGhFAD2-1可通過(guò)調(diào)控GhFAD2-1影響脂肪酸去飽和過(guò)程。此外，KO的棉籽含油量在19.35%-20.62%之間，比CK提高2.21%-8.81%。相反，OE的含油量在17.38%-18.65%之間，與CK相比降低了1.58%-8.28%。相應(yīng)地，KO種仁的含油量為33.05%-34.78%，比CK提高2.16%-7.51%（圖1）。

圖1 轉(zhuǎn)基因植物與對(duì)照植物的鑒定與表型分析

2. pGhFAD2-1參與調(diào)控了棉籽大小

通過(guò)對(duì)成熟棉籽表型的比較發(fā)現(xiàn)，KO種子的長(zhǎng)度和寬度分別為8.44 mm和3.97 mm，較CK種子（9.06 mm和4.23 mm）分別降低6.84%和6.15%，較OE種子（9.21 mm 和 4.40 mm）分別降低 8.36%和9.77%；KO種子的百粒重為8.53 g，較CK（9.35 g）和OE（9.99 g）分別降低8.77%和14.61%。這表明調(diào)控pGhFAD2-1的表達(dá)也會(huì)影響棉籽大小，進(jìn)而改變棉籽的百粒重（圖2）。

圖2 調(diào)控pGhFAD2-1的表達(dá)對(duì)棉籽大小的影響

3. pGhFAD2-1不具備蛋白質(zhì)編碼能力

將pGhFAD2-1和GhFAD2-1的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本以及預(yù)測(cè)的pGhFAD2-1 ORF分別克隆到含有人工突變起始密碼子的GFP表達(dá)載體中。GFP熒光成像顯示，在表達(dá)pGhFAD2-1-GFP 或pGhFAD2-1 ORF-GFP構(gòu)建體的細(xì)胞中，未檢測(cè)到熒光信號(hào)，這與蛋白質(zhì)印跡結(jié)果一致。此外，酵母細(xì)胞異源表達(dá)后的SDS-PAGE分析顯示，含有pGhFAD2-1全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本或其預(yù)測(cè) ORF的構(gòu)建體均未檢測(cè)到蛋白質(zhì)表達(dá)。相比之下，GhFAD2-1 陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)了預(yù)期條帶。這些結(jié)果表明pGhFAD2-1缺乏蛋白質(zhì)編碼能力，其可能作為長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（lncRNA）發(fā)揮作用（圖3）。

圖3 pGhFAD2-1編碼蛋白能力分析

4. pGhFAD2-1互作蛋白的鑒定

基于RNA-pull down分析，鑒定并篩選出了pGhFAD2-1的潛在互作蛋白。進(jìn)一步的質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析顯示，在所有差異豐度蛋白質(zhì)中，與染色體表觀遺傳修飾相關(guān)的組蛋白去乙?；?1（HDT1）差異最顯著。此外，在實(shí)驗(yàn)組中特異性鑒定出40S核糖體蛋白S12（RPS12），而在對(duì)照組中未檢測(cè)到。為了證實(shí) HDT1 或 RPS12 與 pGhFAD2-1之間的相互作用，使用針對(duì) HDT1或RPS12 的特異性抗體進(jìn)行了RNA免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)。進(jìn)一步的qRT-PCR分析顯示，pGhFAD2-1在HDT1或RPS12 特異性免疫沉淀物中顯著富集，表明存在特異性結(jié)合（圖4）。Western Blot及ELISA酶活檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)敲除pGhFAD2-1后，GhFAD2-1的蛋白表達(dá)水平及酶活水平均顯著升高，而GhHDT1蛋白及基因表達(dá)水平則下降。EMSA及單雜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GhHDT1與pGhFAD2-1的203 bp的轉(zhuǎn)錄區(qū)，以及GhFAD2-1的啟動(dòng)子部分區(qū)域（同源于pGhFAD2-1的203 bp的序列）發(fā)生互作。上述結(jié)果表明，pGhFAD2-1通過(guò)招募染色質(zhì)修飾蛋白GhHDT1至GhFAD2-1啟動(dòng)子區(qū)，從而調(diào)控GhFAD2-1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。微尺度熱泳動(dòng)技術(shù)（MST）實(shí)驗(yàn)表明，pGhFAD2-1可以與GhFAD2-1 mRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合核糖體蛋白GhRPS12，調(diào)控GhFAD2蛋白表達(dá)。

圖4 pGhFAD2-1互作蛋白鑒定

5. pGhFAD2-1參與調(diào)控棉籽脂肪酸組分及種子大小的分子機(jī)制

通過(guò)靶向可及染色質(zhì)高通量測(cè)序（ATAC-seq）結(jié)合RNA-seq分析等闡明了pGhFAD2-1參與調(diào)控棉籽脂肪酸組分及種子大小的分子機(jī)制：（1）pGhFAD2-1招募GhHDT1與GhFAD2-1的互作，在轉(zhuǎn)錄水平上抑制GhFAD2-1的表達(dá)，同時(shí)pGhFAD2-1通過(guò)與GhFAD2-1 mRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RPS12，在翻譯水平上抑制GhFAD2蛋白表達(dá)，進(jìn)而影響棉籽發(fā)育過(guò)程中脂肪酸組分的合成。（2）pGhFAD2-1通過(guò)招募GhHDT1，調(diào)控ABA合成相關(guān)基因的附近區(qū)域的染色質(zhì)可及性開(kāi)放程度，從而抑制與ABA合成相關(guān)基因的表達(dá)，參與了調(diào)控棉籽的大小的發(fā)育（圖5）。

圖5 pGhFAD2-1參與調(diào)控棉籽 C18:2 含量和種子大小的分子機(jī)制

這項(xiàng)研究解析了pGhFAD2-1與組蛋白去乙?；窯hHDT1和40S核糖體蛋白GhRPS12相互作用，進(jìn)而參與調(diào)控GhFAD2-1的表達(dá)水平，并影響了種子大小，為棉籽油品質(zhì)和種子大小的遺傳改良提供了新靶點(diǎn)和途徑。此外，與人類和動(dòng)物相比，植物lncRNA的研究尚處于起步階段。與水稻和擬南芥不同，陸地棉的基因組是復(fù)雜的異源四倍體；解析lncRNA pGhFAD2-1的調(diào)控功能及網(wǎng)絡(luò)，有助于深入認(rèn)識(shí)異源多倍體作物的基因表達(dá)與調(diào)控。

石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院劉峰教授、孫杰教授、澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)組織(CSIRO)農(nóng)業(yè)與食品研究所Qian-Hao Zhu研究員為該研究工作共同通訊作者，博士生陳海虹為論文第一作者。研究工作得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金等項(xiàng)目的資助。

論文鏈接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.70291