2025年8月21日，北京大學(xué)程和平、王愛民和吳潤龍共同通訊在Nature Methods在線發(fā)表題為“A versatile miniature two-photon microscope enabling multicolor deep-brain imaging”的研究論文。該研究介紹了 FHIRM-TPM 3.0，這是一款 2.6?g 的微型雙光子顯微鏡，能夠?qū)ψ杂苫顒?dòng)的小鼠進(jìn)行多色深部腦成像。

該系統(tǒng)集成了寬帶抗諧振空芯光纖，具有傳輸損耗低、在 700?nm 至 1,060?nm 范圍內(nèi)色散最小以及激光功率耐受性高的特點(diǎn)。通過校正色差和球差并優(yōu)化熒光收集孔徑，作者實(shí)現(xiàn)了深度超過 820?μm 的皮質(zhì)神經(jīng)元成像，并使用 GRIN 透鏡實(shí)現(xiàn)了單樹突棘分辨率的海馬 Ca2+成像。此外，作者設(shè)計(jì)了三個(gè)可互換的共焦物鏡，允許將視場(chǎng)擴(kuò)展十倍至 1?×?0.8?mm2，橫向分辨率范圍為 0.68?μm 至 1.46?μm。通過在激發(fā)波長為 780 nm、920 nm 和 1,030 nm 的條件下進(jìn)行多色成像，作者研究了清醒 APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠皮層中線粒體和細(xì)胞漿 Ca2+活性與淀粉樣斑塊沉積之間的關(guān)系。因此，F(xiàn)HIRM-TPM 3.0 提供了一個(gè)適用于各種腦成像場(chǎng)景的多功能成像系統(tǒng)。

微型顯微鏡的發(fā)展在揭示自然行為動(dòng)物行為的神經(jīng)基礎(chǔ)方面發(fā)揮了重要作用。雖然單光子熒光顯微鏡一直是頗具價(jià)值的工具，但多光子成像具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，例如固有的光學(xué)切片和深層組織穿透能力，使其適用于在突觸、神經(jīng)元和局部回路層面進(jìn)行體積或多平面記錄。在長期努力的基礎(chǔ)上，微型雙光子顯微鏡 (m2PM) 和微型三光子顯微鏡 (m3PM) 的出現(xiàn)，為此前在物理受限動(dòng)物身上無法實(shí)現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)范式研究提供了動(dòng)力。例如，對(duì)自由行為動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)相關(guān)的動(dòng)態(tài)去抑制微電路、編碼社會(huì)新奇感的稀疏 GABA 能神經(jīng)集群、不受約束行為過程中神經(jīng)元的空間調(diào)節(jié)以及睡眠-覺醒周期中小膠質(zhì)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

盡管取得了這些進(jìn)步，當(dāng)前的 m2PM 技術(shù)仍然面臨著一些未解決的挑戰(zhàn)，特別是在多色熒光成像、實(shí)現(xiàn)更大的成像深度和獲得更大、可擴(kuò)展的視場(chǎng) (FOV) 方面。在流行的 m2PM 和 m3PM 系統(tǒng)中，飛秒激光脈沖的傳輸依賴于光子帶隙空芯光纖 (PBG-HCF)，每個(gè)光纖僅傳輸特定波長的光。因此，最近的報(bào)告中的雙色成像利用單個(gè)激光器激發(fā)兩種不同的指示劑，例如用于 GCaMP6 和 tdTomato 的 920 nm，盡管效率有所降低。在一項(xiàng)多色雙光子內(nèi)窺鏡研究中，Guan 等人使用雙包層光纖傳輸 830 nm 和 1,050 nm 波長，同時(shí)通過同步兩個(gè)相干脈沖產(chǎn)生 927 nm 的第三個(gè)虛擬波長，從而能夠同時(shí)對(duì)四種熒光團(tuán) (CFP、GFP、YFP 和 RFP) 進(jìn)行成像。然而，該系統(tǒng)的 FOV 為 120 μm，幀率為 1.5 Hz，需要改進(jìn)才能對(duì)大量神經(jīng)元進(jìn)行功能成像。

在最先進(jìn)的臺(tái)式系統(tǒng)中，雙光子顯微鏡可以實(shí)現(xiàn)超過 800 μm 的皮層成像深度，而三光子顯微鏡可以達(dá)到高達(dá) 1.4 mm 的深度，用于神經(jīng)元 Ca2+活動(dòng)成像。最近開發(fā)的 m3PM 系統(tǒng)達(dá)到了 1.2 mm 的深度，能夠?qū)ψ杂苫顒?dòng)的小鼠進(jìn)行海馬 CA1 區(qū) Ca2+成像。這一結(jié)果令人振奮，因?yàn)樗砻魑⑿投喙庾酉到y(tǒng)可以接近其臺(tái)式同類系統(tǒng)的成像深度。由于先前報(bào)道的 m2PM 成像深度大多在 250 μm 左右（未使用 GRIN 透鏡），因此有必要進(jìn)一步開發(fā) m2PM，以充分發(fā)揮其在自由活動(dòng)動(dòng)物深部腦成像方面的潛力。

m2PM 的視場(chǎng) (FOV) 一直在穩(wěn)步增長，從 FHIRM-TPM 的 130?×?130 μm2 增加到 FHIRM-TPM (2.0) 的 420?×?420?μm2，最近甚至達(dá)到了 1?×?0.788?mm2。此外，與臺(tái)式系統(tǒng)類似，光學(xué)可擴(kuò)展的視場(chǎng)優(yōu)勢(shì)有助于平衡分辨率要求和所研究的神經(jīng)元群組規(guī)模，使 m2PM 能夠以不同的放大倍數(shù)研究同一區(qū)域。克服上述限制將大大增強(qiáng) m2PM 技術(shù)的適用性。

作者開發(fā)了 FHIRM-TPM 3.0，這是一款多功能的 m2PM 系統(tǒng)，在先前開發(fā)的基礎(chǔ)上融入了多項(xiàng)理想特性。通過設(shè)計(jì)和制作寬帶反諧振空芯光纖 (AR-HCF)，并系統(tǒng)地優(yōu)化整體光學(xué)設(shè)計(jì)，作者實(shí)現(xiàn)了三種激發(fā)波長（780 nm、920 nm 和 1030 nm）下的多色成像，并將皮層成像深度擴(kuò)展至 820 μm 以上。此外，通過在三個(gè)可互換的不同放大倍數(shù)共焦物鏡之間切換，作者的顯微鏡實(shí)現(xiàn)了十倍的視場(chǎng)變化，從而能夠靈活地滿足各種實(shí)驗(yàn)需求。

圖1FHIRM-TPM 3.0的設(shè)計(jì)和測(cè)試（圖源自Nature Methods）

參考消息：

https://www.nature.com/articles/s41592-025-02780-6