師弟

師姐！我最近做熒光染色實驗都快崩潰了……細胞爬片太考驗我的耐心和技術了，細胞分布全看運氣，成像效果也不咋行，抗體快浪費不起了??！

當年我也是這樣過來的，不過現(xiàn)在可以試試 ibidi μ-Slide VI 0.4 六通道載玻片。免疫熒光染色步驟大大簡化，不僅細胞分布的更均勻，換液染色也不擔心細胞被污染，而且一張玻片就能完成 6 次重復，還巨省抗體，一個孔 30 μl 就夠！還能做細胞灌流實驗呢！（現(xiàn)在還有不限名額免費試用哦，點這里立馬申請！）

師姐

你也在為熒光染色實驗細胞分布不均、成像效果差和試劑成本高發(fā)愁嗎？ibidi μ-Slide VI 0.4 六通道載玻片，獨特通道設計能消除培養(yǎng)基彎液面，保證細胞均勻分布，只需 30 μL 抗體溶液就能填滿通道，大大降低試劑消耗，用高成本抗體也不心疼！高通量并行實驗首選，點擊圖片或掃碼即可領取免費試用機會！

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手把手教你高效完成細胞免疫熒光染色

（以 HT-1080 細胞為例）

1

培養(yǎng)細胞

建議提前一天將 ibidi μ-Slide 通道載玻片和細胞培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱內以平衡氣壓。

收集細胞懸液，調節(jié)細胞密度至 1×103 cells/ml，載玻片的每個通道中迅速加入 30 μL 細胞懸液。

輕輕傾斜載玻片并敲擊其側邊，以去除通道中可能殘留的氣泡。使用附帶的蓋子封閉兩側儲液池。將載玻片連同載玻片滑架放入培養(yǎng)箱孵育 1 h，使細胞貼壁。

向每個儲液池中小心注入 60 μL 無細胞培養(yǎng)基，防止引入氣泡。

將載玻片連同載玻片滑架放入培養(yǎng)箱孵育過夜。

2

更換培養(yǎng)基：無斷流更換法

使用移液器吸取儲液池中的培養(yǎng)基，確保不觸及并吸出通道內部的任何液體。輕輕地將 120 μL 無細胞培養(yǎng)基注入儲液池中，以補充通道中的培養(yǎng)基。

在從對側的儲液池吸取舊培養(yǎng)基時，務必保持謹慎，以防移液操作沖走已貼壁的細胞或細胞團。每個儲液池應使用 60 μL 無細胞培養(yǎng)基進行重新填充。

3

細胞固定、透化及封閉

采用無斷流更換法（如上圖所示），使用杜氏磷酸鹽緩沖液替換細胞培養(yǎng)基以洗滌細胞。吸去大部分的杜氏磷酸鹽緩沖液，但需保留一小部分以避免細胞損傷。

用 100 μL 10% 福爾馬林固定細胞 20 min。

用 200 μL 杜氏磷酸鹽緩沖液通過無斷流更換法先后洗滌細胞 3 次。

吸去大部分的杜氏磷酸鹽緩沖液，但需保留一小部分以避免細胞損傷。加入 100 μL 透化緩沖液，孵育細胞 5 min。

用 200 μL 杜氏磷酸鹽緩沖液通過無斷流更換法洗滌細胞。吸去大部分的杜氏磷酸鹽緩沖液，但需保留部分體積以避免細胞損傷。

用 100 μL封閉緩沖液封閉細胞 20 min。

封閉完成后，再次使用 200 μL 杜氏磷酸鹽緩沖液，通過無斷流更換法洗滌細胞。

4

熒光染色

徹底排空儲液池和通道內的杜氏磷酸鹽緩沖液。

用 5 mL 注射器（此舉可最大程度地避免引入氣泡）迅速將 30 μL iFluor 488 標記鬼筆環(huán)肽溶液加入到通道中。

避光孵育 20 min——自此時起，應確保樣品處于持續(xù)的黑暗環(huán)境中。

使用 200 μL 杜氏磷酸鹽緩沖液，通過無斷流更換法先后洗滌細胞 2 次。

5

封片及成像

徹底排空儲液池和通道內的杜氏磷酸鹽緩沖液，隨后立即注入含有 DAPI 的 ibidi 封片劑以進行細胞核染色，直至通道被完全填充。

將封片完畢后的載玻片 4°C 避光保存（至多可保存 4 周），直至進行鏡檢成像。

在熒光顯微鏡下使用適當?shù)臑V片組和 ibidi 鏡油鏡檢。

如果你還需要做流體剪切實驗或長期灌流（比如血管內皮細胞、肝細胞培養(yǎng)），推薦ibidi μ-Slide I Luer 單通道載玻片，能精準控制流體環(huán)境，模擬體內生理條件，連接系統(tǒng)也特別方便！可掃描下方二維碼查看并免費領取試用裝！

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內容策劃：鄒禮平

內容審核：朱卿

題圖來源：自己做的