D-LMBmapX: Generalised Deep Learning Pipeline for 5D Whole-brain Circuitry Profiling

5D全腦環(huán)路剖面分析的通用深度學習流程

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.02.25.639766v2.full.pdf

摘要

理解全腦環(huán)路發(fā)育對于揭示與異常神經布線相關的疾病起源至關重要，但進展因缺乏用于精確、全面分析的工具而受限。大腦發(fā)育高度動態(tài)且具有區(qū)域特異性，在早期階段個體間差異顯著，且目前尚無任何現有方法能在任意發(fā)育階段實現全腦剖面分析。發(fā)育中軸突形態(tài)的快速變化進一步加劇了分割的復雜性。在此，我們提出D-LMBmapX，一種用于自動化全腦環(huán)路剖面分析的深度學習流程，適用于整個出生后發(fā)育過程。D-LMBmapX通過相鄰錨點階段構建樣本推斷圖譜，從而實現任意時間點的精確配準。通過開發(fā)用于泛化軸突和胞體分割的基礎模型，它支持定量的介觀尺度發(fā)育連接組學分析，并通過去甲腎上腺素能投射的空間-時間剖面分析得以驗證。D-LMBmapX還實現了穩(wěn)健的跨模態(tài)和跨維度配準，包括將單個2D切片精確對齊到3D參考圖譜，并為多樣化的生物醫(yī)學空間數據集提供可推廣的5D分析策略。

引言

深入了解神經連接是理解大腦功能組織方式的基礎。在過去的幾十年里，在繪制哺乳動物神經回路方面取得了巨大成功，特別是在介觀尺度連接組學領域1–5。相關資源，包括高分辨率參考腦圖譜，已迅速擴展6–10。組織透明化技術與光片熒光顯微鏡（LSFM）的結合，為高通量、全腦3D介觀尺度連接映射開辟了顯著機遇11–16。隨著這些大規(guī)模數據集的激增，對相應分析工具的需求變得尤為迫切，為此我們開發(fā)了D-LMBmap，該工具采用深度學習算法進行全腦環(huán)路剖面分析，可在單一工作流中解決自動軸突分割、腦區(qū)分割和全腦3D配準問題17。

關鍵的是，在發(fā)育過程中繪制神經連接能夠揭示成年網絡如何建立，并為由異常布線引起的疾病提供必要的解剖學背景18,19。最近對成年和幼蟲果蠅大腦的全腦連接組學分析表明，約0.5%的神經元存在發(fā)育性布線缺陷，由此提出了此類錯位可能促成了個體差異和對精神健康障礙易感性的假說20。然而，與成人大腦相比，在發(fā)育中的哺乳動物大腦中繪制連接性面臨著獨特的挑戰(zhàn)。在成人中，一個單一的時間點可以作為電路架構的穩(wěn)定參考。相比之下，發(fā)育連接組學必須捕捉貫穿成熟過程的快速而連續(xù)的變化，需要跨越多個發(fā)育階段進行時空映射，導致工作量增加了一個數量級以上。

在出生后的小鼠大腦中，結構穩(wěn)定遠未在P28之前達成21。在此期間，軸突纖維表現出多樣且階段特異性的形態(tài)，通常與成年大腦中所見有顯著不同22。大腦發(fā)育在出生后早期高度動態(tài)且具有區(qū)域特異性，每個系統(tǒng)都在其自身的時間線上成熟。例如，軀體感覺皮層在P0左右接收丘腦皮質傳入，到P3–P4時，桶狀可塑性的關鍵窗口基本關閉，桶狀凹陷和隔膜在P7時清晰界定。在聽覺系統(tǒng)中，耳蝸和腦干成熟使聽力在P10–P12左右開始。在視覺系統(tǒng)中，眼睛在P12–P14左右睜開，隨后立即出現功能性視覺反應23。其他回路，如下丘腦系統(tǒng)，在出生后前兩周內也經歷快速的形態(tài)和突觸變化24。為了準確捕捉這種回路動力學，全腦配準和軸突分割都必須在高時間分辨率下進行——理想情況下是在任意發(fā)育日進行。

此外，發(fā)育過程中顯著的個體間變異性增加了這種復雜性。與成年大腦相比，發(fā)育中大腦的腦大小、結構組織和神經元形態(tài)變異更大。這種變異性在出生后早期階段尤為明顯，此時快速生長和發(fā)育時機上的微小差異即可產生明顯的解剖學差異，即使在同窩仔中也是如此。環(huán)境因素——如營養(yǎng)、母體護理和微小的遺傳變異——進一步放大了這些差異。

當前的方法需要近乎每日重復進行圖譜構建、全腦配準和軸突分割，涉及大量人工輸入。這使得工作量不切實際，并且由于發(fā)育變異性，仍可能導致準確性降低。此外，盡管3D全腦成像日益可用，許多環(huán)路剖面分析仍依賴于二維數據，包括連續(xù)切片法10,25–28、艾倫腦圖譜等社區(qū)資源29以及傳統(tǒng)組織學。要充分挖掘這些數據集的價值，需要將2D信息注冊到3D框架中，以實現跨模態(tài)的整合與比較。

為應對這些挑戰(zhàn)，我們開發(fā)了D-LMBmapX，這是一種用于在任意出生后階段自動化全腦環(huán)路剖面分析的深度學習流程，通過適應個體樣本的泛化模塊提供精確、高效的分析。D-LMBmapX通過整合發(fā)育時間和多重信號集成，引入了動態(tài)的4D和5D能力。我們通過對全腦酪氨酸羥化酶（TH）陽性投射進行剖面分析來驗證我們的方法，揭示了TH+神經支配在整個出生后發(fā)育過程中的區(qū)域特異性和動態(tài)模式。我們還實現了穩(wěn)健且自動化的跨模態(tài)和跨維度配準，通過將艾倫研究所發(fā)育ISH數據集29中的基因定義神經元群體與我們的4D TH+胞體圖譜對齊得以證明，并在一個統(tǒng)一的5D解剖-分子框架內使用多種標記物精煉神經元亞型分類。除小鼠大腦外，D-LMBmapX還為跨年齡、跨模態(tài)和跨維度的多重配準提供了可推廣的策略，適用于多樣化的生物醫(yī)學數據集。

結果

發(fā)育性神經環(huán)路定量的綜合框架

D-LMBmapX 由相互連接的模塊組成，始于數據輸入，最終在任意出生后階段的3D樣本推斷圖譜中實現自動化的軸突/胞體量化與可視化（5D，圖1）。每個核心組件均由先進的深度神經網絡（DNNs）驅動，可作為獨立模塊運行，或組合使用以實現自動化的5D全腦環(huán)路剖面分析，支持跨平臺數據集的可靠比較。

利用一種新穎的配準方法，我們首先在七個錨點出生后階段（P0、P4、P7、P10、P14、P21和P28）構建了高分辨率平均模板大腦。隨后，通過將艾倫小鼠腦公共坐標框架（CCFv3）7依次配準到這些模板上，界定了分層的腦結構。為解決七個錨點圖譜未覆蓋的階段，我們開發(fā)了一種樣本推斷圖譜構建策略。該方法通過從相鄰錨點階段推斷圖譜，自適應地界定腦區(qū)，從而實現在任意出生后時間點的精確全腦配準（圖1A）。為實現貫穿發(fā)育過程的全腦軸突和胞體剖面分析，我們開發(fā)了一個通用的基礎模型CircuitFound，用于自動化分割，能夠準確分割不同發(fā)育階段間形態(tài)各異的軸突和胞體。結合全腦配準模型，這使得D-LMBmapX能夠接受來自任意出生后大腦的輸入，并輸出注冊到相應發(fā)育圖譜上的區(qū)域特異性量化結果及軸突和胞體分布的3D可視化（圖1B）。這個跨維度和跨模態(tài)模塊支持通過相似性驅動的2D到3D空間對齊和配準，對2D組織切片進行端到端的定量分析——估算每張切片的姿態(tài)，通過可變形配準校正組織形變，并將定量信號映射到圖譜坐標系中以進行區(qū)域分析（圖1C）。

D-LMBmapX 將這些組件整合進一個用戶友好的開源軟件平臺，支持通過高級應用程序編程接口（APIs）進行定制化，并包含一個圖形界面，用于選擇和執(zhí)行預訓練的深度學習模型（圖1D）。

多約束非剛性4D腦圖譜構建流程

為實現任意出生后階段的全腦配準，我們首先為七個錨點階段構建了高分辨率3D腦圖譜。我們收集了從P0到P28的LSFM腦圖像，每個階段至少使用30個半腦來構建平均模板。為最大限度減少樣本制備和成像帶來的變異性，我們應用了一系列圖像預處理策略，包括N4偏場校正30、強度重標定和3D自適應直方圖均衡化31。對于每個階段，我們通過對所有大腦進行配準至共同中心并計算體素級平均值，創(chuàng)建初始參考模板（圖2A）。雖然我們整合了傳統(tǒng)的圖譜構建流程32,33——其中包括剛性、仿射和B樣條配準——但我們進一步使用一種定制的2.5D非剛性配準方法對模板進行了精煉。該方法使用基于U-Net的神經網絡在冠狀面和水平面上執(zhí)行2D配準。然后，我們將每個視圖的3D配準結果組裝起來，并計算3D一致性損失以指導迭代精煉。這一過程允許每個大腦在共享的形變空間內更新模板，從而生成高分辨率、精細的參考模板（圖2B）。

在為每個發(fā)育階段建立了精細的腦模板后，我們的下一個挑戰(zhàn)是為每個階段界定數百個腦區(qū)。在此規(guī)模下進行手動標注極其耗費人力，因此我們開發(fā)了一個用于圖譜映射的自動化流程。

并利用跨階段和跨模態(tài)配準進行構建（圖2C）。我們首先將成年小鼠腦圖譜（艾倫CCFv3）配準到我們的P28腦模板。此過程結合了腦風格遷移、多約束配準17以及我們的2.5D非剛性配準方法。具體而言，我們開發(fā)了一種基于擴散的腦風格遷移方法，將處于STPT模態(tài)的艾倫CCFv3圖像轉換為LSFM模態(tài)。我們通過自動標注六個主要腦區(qū)并手動標注八個較小區(qū)域，創(chuàng)建了多個腦結構約束（圖S1A）。這種多約束策略緩解了在傳播腦區(qū)界定過程中出現的配準偏移和誤差累積問題（圖S1B）。在完成從艾倫CCFv3到P28模板的跨模態(tài)和跨階段配準后，該流程自動界定了數百個腦區(qū)。隨后，我們通過順序配準——P28到P21，P21到P14，依此類推——將這些標注傳播到更早的階段，最終構建出覆蓋全部七個出生后階段的完整圖譜系列（圖2D，圖S2）。

為評估我們4D腦圖譜構建流程的有效性并評估所得D-LMBmapX圖譜的準確性，我們進行了一系列與現有方法和參考圖譜的對比分析。我們首先將我們的全腦配準流程與ANTs34這一廣泛使用的非剛性配準方法進行基準測試，后者也被用于構建DevCCF圖譜32。在完成配準后，我們在整個大腦范圍內計算了區(qū)域級Dice分數，以評估解剖學配準精度。為確保公平比較，我們在兩種流程中均采用了相同的預處理步驟。我們的結果表明，D-LMBmapX在多個腦區(qū)始終獲得更高的Dice分數，表明我們的2.5D非剛性配準方法性能更優(yōu)（圖S1C）。接著，我們通過將D-LMBmapX構建的圖譜與兩個領先的發(fā)育腦圖譜——DevCCF32和DeMBA35——進行比較，評估了其準確性。由于這些圖譜最初采用不同的配準策略構建，我們使用相同的D-LMBmapX配準流程將獨立的腦樣本重新注冊到每個圖譜，以確保公平比較。由于DevCCF和DeMBA35并未涵蓋D-LMBmapX中可用的所有出生后階段，我們將評估范圍限定在三個圖譜共有的階段。對于DeMBA35，僅納入真實的（真實樣本）圖譜進行分析，排除了其插值（合成）圖譜。隨后，區(qū)域級Dice分數被用于評估解剖學對應關系，D-LMBmapX顯示出持續(xù)更高的解剖學對應性（圖2E，圖S3）。

綜上所述，這些結果驗證了我們的多約束非剛性流程在全腦配準方面的有效性，并證明D-LMBmapX能生成高精度的4D腦圖譜，能夠捕捉發(fā)育動力學，且在解剖學精度上優(yōu)于現有資源。

接下來，我們表征了跨越七個出生后階段的全腦和區(qū)域層面的發(fā)育體積變化（圖2F和G，表S6）。在全腦層面，總體積穩(wěn)步增加，其中P0至P7之間增長最快（圖2G）。在區(qū)域層面，276個區(qū)域被分為13個主要腦區(qū)，顯示出獨特且動態(tài)的發(fā)育軌跡（圖2F）。皮質和海馬區(qū)域、紋狀體和小腦大體上表現出單調增長，盡管皮質亞區(qū)有所差異：無顆粒島葉皮層（AI）在P7時達到平臺期，初級運動皮層（MOp）在P14時達到峰值，眶額皮層（ORB）在P21時達到峰值（圖2G）。相比之下，丘腦區(qū)域在P14左右達到峰值，而其他主要腦群則表現出更異質、階段特異性的變化模式（圖2F）。

這些發(fā)現強調，大腦成熟是非線性和區(qū)域性不同步的，不同腦區(qū)經歷著獨特的發(fā)育軌跡，并在不同的出生后時間點達到關鍵里程碑——其中一些可能落在本文所描繪的七個錨點階段之外。這種生物學復雜性要求在任意出生后日期進行全腦配準，以確保解剖學準確性。然而，DeMBA35中使用的基于插值的策略，通過假設相鄰時間點之間的腦發(fā)育平滑且均勻來生成中間階段圖譜，未能考慮到這些區(qū)域特異性的動態(tài)變化。因此，此類插值圖譜可能會引入解剖學不準確性，尤其是在快速或異質性發(fā)育時期。

任意時間點的樣本推斷全腦配準

為實現在任意出生后階段的精確全腦配準，我們開發(fā)了一種流程，該流程通過將待研究的腦樣本與其相鄰發(fā)育階段的圖譜相結合來構建樣本推斷圖譜（圖3A）。為演示該流程，我們以P10大腦為例，從其相鄰階段（P7和P14）構建一個樣本推斷的P10圖譜。首先，將P7和P14圖譜注冊到P10大腦圖像上，在保留其原始解剖標簽的同時生成兩個形變后的圖譜，形成一個類似P10的空間。隨后，這兩個類似P10的圖譜按體素進行平均，形成一個整合了兩側階段解剖特征的初始參考模板。接著，根據圖2A所示的圖譜構建流程，這兩個類似P10的圖譜被迭代注冊到該初始平均模板上，從而產生一個經過精煉、具有更高解剖一致性的樣本推斷P10圖譜（圖S4A）。接下來，為界定腦樣本，原始P10大腦被注冊到此樣本推斷圖譜上，并轉移所有解剖標簽。為進一步提升配準的可靠性和通用性，我們設計了一個基于互學習的配準框架，該框架能自動識別可靠的解剖約束。具體而言，顯示出兩個來源（類似P10的P7圖譜和類似P10的P14圖譜）之間強空間對應關系的腦區(qū)被自動選擇并用作約束，以指導從原始P10大腦到樣本推斷圖譜的配準。在此，兩個2.5D配準模型分別基于所選腦區(qū)交集和并集的約束進行互訓練（圖S4B）。

該策略利用了可靠對齊的腦區(qū)作為空間約束，從而提升了整個大腦的配準性能（圖S4C）。重要的是，所有腦區(qū)約束——包括主要和次要區(qū)域——均是自動獲得的，無需任何手動標注。為評估樣本推斷圖譜與真實P10圖譜之間的相似性（圖3B），我們將P10腦樣本分別注冊到兩者以及相鄰階段圖譜（P7和P14）。Dice分數分析顯示，對于主要或次要腦區(qū)，樣本推斷圖譜與真實P10圖譜在配準精度上無顯著差異，而注冊到P7或P14則導致顯著更低的精度（圖3C）。當使用P7作為推斷階段時，也獲得了可比的結果（圖S5A & B）。接下來，我們比較了將P10腦樣本配準到DeMBA插值的P10圖譜與配準到我們的樣本推斷P10圖譜的配準性能。Dice分數分析表明，注冊到我們的圖譜在全局和各個獨立腦區(qū)層面均表現出更優(yōu)的精度（圖3D & E）。

綜合來看，這些結果證明了我們的樣本推斷全腦配準流程能夠在任意出生后日期實現精確配準。由此生成的樣本推斷圖譜所達到的配準精度與真實圖譜相當，并顯著優(yōu)于插值替代方案。

用于樣本推斷4D圖譜生成與配準的通用流程

我們的樣本推斷配準流程不僅適用于發(fā)育中的小鼠大腦，

還支持對人類胎兒和嬰兒數據集進行4D分析。對于一個29周的胎兒大腦和一個7個月大的嬰兒大腦，我們通過將樣本本身與其相鄰階段的圖譜（例如，23周和35周，或4個月和10個月）整合，生成了樣本推斷圖譜。隨后，每個大腦都被注冊到其自身的樣本推斷圖譜、相應的真值圖譜以及相鄰階段的圖譜。Dice分數分析顯示，注冊到樣本推斷圖譜的精度與注冊到真值圖譜的精度相當，并顯著優(yōu)于相鄰階段配準的精度（圖3F & 圖S6）。

由通用基礎模型實現的5D全腦環(huán)路剖面分析

全腦環(huán)路剖面分析要求深度學習模型能夠有效分割神經結構（如軸突和胞體），這些模型需在大量且標注良好的樣本上進行訓練。為消除耗時費力的手動軸突標注，我們此前已開發(fā)了自動化標注和數據增強策略17。然而，神經結構，特別是軸突投射，在發(fā)育過程中經歷顯著的形態(tài)變化。這種形態(tài)多樣性對跨階段穩(wěn)健的環(huán)路剖面分析構成了重大挑戰(zhàn)。在單一階段上訓練的分割模塊往往無法泛化，且為每個階段訓練新模型在時間和資源上成本過高。為應對這一挑戰(zhàn)，我們開發(fā)了CircuitFound，這是一個集成到D-LMBmapX中的通用基礎模型，用于軸突和胞體分割，能有效適應多樣的神經形態(tài)和腦圖像（圖4）。

CircuitFound的構建包含三個步驟：自監(jiān)督預訓練、自動化樣本標注和微調。超過100,000個3D立方體從跨越七個出生后階段的抗TH染色LSFM腦樣本中隨機裁剪出來，用于由3D掩碼自編碼器（MAE）進行的自監(jiān)督預訓練。視覺變換器（ViT）36編碼器嵌入未掩碼的塊，與僅依賴像素級重建的傳統(tǒng)MAE不同，我們引入了一個第二解碼器分支來重建有向梯度直方圖（HOG）38（圖4A）。這種雙解碼器設計使模型能夠捕捉通用圖像特征和基于梯度的結構線索，使其能更好地表征對精確分割至關重要的軸突長程、樹狀形態(tài)。消融研究結果支持了我們在預訓練中策略的有效性（圖S7A）。

許多神經系統(tǒng)，如多巴胺能系統(tǒng)，其胞體分布于多個腦區(qū)而非局限于單一核團。因此，為準確重建環(huán)路，分割必須區(qū)分胞體信號和軸突投射，因為混淆二者可能導致連接性的誤判。因此，CircuitFound被設計為同時刻畫軸突和胞體，預訓練后兩者均可自動標注。我們采用了之前在D-LMBmap中報道的方法進行軸突標注，并基于“分割任意模型”（SAM）39開發(fā)了一個新的3D胞體標注流程。在此流程中，唯一的手動輸入是在少數2D切片中為每個胞體提供一個點提示；SAM隨后會自動根據這些提示分割胞體。為進一步分離粘連的胞體，我們引入了一種基于距離圖的分水嶺算法（圖4B）。這種輕量級策略使得多樣化的軸突和胞體分割任務能夠高效且可擴展地進行標注。最后，我們使用標注的立方體對預訓練的基礎模型進行了微調。由于直接微調ViT編碼器因參數量大而效率低下且需要大量數據，我們通過引入一個并行的卷積神經網絡（CNN）解決了這一問題。在每一層，ViT編碼器的輸出都與相應的CNN輸出融合，從而實現了更快的收斂和更高的精度（圖4C）。通過并行ViT和CNN，我們的框架僅需少量標注樣本即可實現對軸突和胞體的魯棒全腦預測。

配備了CircuitFound模塊，D-LMBmapX在軸突和胞體分割方面展現出強大的泛化能力。為展示其在跨腦區(qū)和跨發(fā)育階段全腦環(huán)路剖面分析中的有效性，我們將其應用于表征七個出生后階段的去甲腎上腺素能回路。來自P0、P4、P7、P10、P14、P21和P28小鼠的大腦經整體免疫組織化學、iDISCO組織透明化處理和LSFM成像處理。我們使用酪氨酸羥化酶（TH）免疫染色標記多巴胺能和去甲腎上腺素能神經元及其軸突投射。D-LMBmapX成功分割了這些標記結構，將每個大腦注冊到其對應的發(fā)育階段圖譜，并計算了每個階段TH+軸突和胞體的密度圖（圖4D，圖S8，視頻S1-3）。與傳統(tǒng)的深度模型如TrailMap12、D-LMBmap40和ACE41相比，D-LMBmapX無需針對單個階段進行樣本訓練。此外，D-LMBmapX取得了更優(yōu)的性能，尤其是在使用較少標注樣本時（圖S7B）。在軸突分割方面，D-LMBmapX在CI Dice、CI Precision、CI Recall和Dice分數上始終優(yōu)于TrailMap，覆蓋不同腦區(qū)和整個大腦的平均值（圖4E和圖S7C）。在胞體分割方面，D-LMBmapX在Dice和Precision分數上顯著優(yōu)于ACE，后者是目前最先進的神經細胞體映射流程（圖4F）。

使用D-LMBmapX，我們量化了跨越13個主要腦區(qū)的260多個腦區(qū)的TH+軸突密度，并生成了產后軸突支配的4D圖譜（圖4G，表S6，視頻S2&3）。該分析揭示了高度異質性、區(qū)域特異性的TH+支配模式。在同皮質和嗅覺區(qū)域，軸突密度隨時間普遍增加，而其他區(qū)域則表現出顯著的時空動態(tài)（圖4G–H）。這包括在特定發(fā)育階段的急劇增加（例如，NTS）、瞬時峰值（例如，PVH和BST）、從出生起的穩(wěn)定水平，甚至漸進性下降（圖4H，圖S9）。據我們所知，這是首個TH+軸突支配的4D全腦圖譜。值得注意的是，軸突密度的下降無法完全由區(qū)域體積變化解釋，暗示了軸突修剪的貢獻（圖S9）。

通用的跨維度與跨模態(tài)配準

盡管3D全腦成像正被越來越多地采用，但大量可用的環(huán)路剖面數據仍為二維。這包括以連續(xù)切片方式獲取數據的先進成像技術、主要社區(qū)資源（如艾倫腦圖譜），以及許多神經科學實驗室中廣泛使用的2D組織學。為確保更廣泛的神經科學界能充分受益于多樣化的連接性映射資源并實現跨平臺數據比較，我們在D-LMBmapX中開發(fā)了跨維度和跨模態(tài)配準功能。

跨維度和跨模態(tài)配準流程包括切片預處理、跨模態(tài)風格遷移、空間對齊以在3D參考圖譜中識別最佳匹配切片，以及最終的2D到3D配準（圖5A）。此前，我們開發(fā)了首個基于CycleGAN的腦特異性風格遷移方法，該方法學習不同成像模態(tài)間的無監(jiān)督映射17。然而，這種方法每當引入新的模態(tài)時都需要從頭重新訓練模型。為獲得更具泛化性和一致性的跨模態(tài)風格遷移，我們開發(fā)了一種基于擴散模型的新方案，該方案可將源腦圖像模態(tài)轉換為任意給定的目標風格（圖S10A）。在訓練過程中，僅使用目標腦圖像。每張圖像通過逐步添加噪聲直至其無法與隨機噪聲區(qū)分來進行漸進式降級。隨后，模型通過去噪過程學習重建原始目標圖像。

為提升穩(wěn)定性和準確性，我們整合了兩個模塊：(i) 腦邊緣約束，確保重建圖像中的結構邊界與輸入保持一致；(ii) 一個去噪U-Net，用于分割主要腦區(qū)（BS, CB, CTX, HPF, CP, OLF），以保留區(qū)域邊界。在預測步驟中，來自其他模態(tài)的源大腦通過訓練好的模型轉換為目標風格，并利用源圖像的結構邊緣引導重建，以維持解剖細節(jié)。這種基于擴散的方法具有兩大主要優(yōu)勢：它在不同模態(tài)間保留了邊緣和精細細節(jié)，并且對于給定的目標模態(tài)只需訓練一次，而與源模態(tài)無關?；鶞时容^表明，D-LMBmapX在腦風格遷移方面表現優(yōu)異，包括從LSFM到STPT（艾倫CCFv3）以及從艾倫組織學2D切片到我們的發(fā)育LSFM腦圖譜的轉換（圖S10B & C）。

在經過預處理和風格遷移以匹配目標3D腦模態(tài)后，每張2D切片均通過我們新開發(fā)的模塊自動定位并注冊到3D圖譜中（圖5B）。使用Harris角點檢測器42自動檢測2D切片和3D圖譜每個正交切面（例如，矢狀面）上的標志點，并用尺度不變特征變換（SIFT）43特征進行描述。根據匹配標志點的數量，識別出K個最相似的正交切面，并應用隨機抽樣一致性（RANSAC）算法44來估計將2D切片與這些候選切面對齊的最佳初始旋轉角度。為進一步精煉配準，D-LMBmapX在估計的方位周圍進行細粒度搜索，通過改變偏航角和滾轉角，根據互信息相似性選擇最佳匹配切片。為評估定位精度，我們對2D切片施加受控的旋轉和平移擾動，然后使用D-LMBmapX將其配準到3D圖譜。結果在偏航角、滾轉角和平移方向上均顯示出低誤差，證實了我們流程在可靠2D到3D配準方面的穩(wěn)健性和精確性（圖5C）。

為證明D-LMBmapX能夠實現系統(tǒng)性環(huán)路剖面分析所需的精確2D到3D全腦配準，我們表征并注冊了與去甲腎上腺素能系統(tǒng)相關的標記基因表達。我們首先比較了P4、P14和P28時艾倫2D原位雜交（ISH）切片與抗TH染色的3D LSFM大腦之間的Th+胞體密度（圖5D，圖S11）。在包含多巴胺能或去甲腎上腺素能神經元的16個腦區(qū)中，標準化后的區(qū)域級Th+胞體密度在兩組數據集中高度對齊（圖5E）。接下來，為進一步通過整合2D分子特征與3D解剖結構來精煉細胞類型表征，我們針對三個基因標記物——Th、Slc6a2 和 Slc6a3——在P4、P14和P28時，對涵蓋腹側被蓋區(qū)（VTA）和藍斑核（LC）的單個艾倫2D ISH切片進行了剖面分析和注冊。由D-LMBmapX生成的胞體密度熱圖準確地定位了VTA中的多巴胺能神經元（Th+, Slc6a2?, Slc6a3+）和LC中的去甲腎上腺素能神經元（Th+, Slc6a2+, Slc6a3?）45（圖5F，圖S12）。綜上所述，這些結果表明，D-LMBmapX能夠將單個2D組織學切片精確地放置在3D圖譜中，即使在成像位置、旋轉或形變存在差異，甚至沒有連續(xù)的系列切片的情況下，也能穩(wěn)健地匹配它們。據我們所知，這代表了首個實現自動化跨維度和跨模態(tài)全腦配準的工作流，為整合多樣化的生物醫(yī)學空間圖像提供了一個通用框架。

介觀尺度連接組學的迅速興起，加之機器學習的進步，加速了將環(huán)路和多組學數據注冊到標準化腦圖譜的趨勢。然而，與為成年大腦日益豐富的工具和資源46–51相比，針對發(fā)育中大腦的等效資源仍然稀缺。在此，我們提出了

D-LMBmapX，一個用于在出生后發(fā)育過程中對小鼠腦環(huán)路進行5D映射的端到端深度學習系統(tǒng)。D-LMBmapX包含自動化工具，可實現跨所有出生后階段的全腦配準及胞體/軸突分割，從而支持發(fā)育連接組學的高效且穩(wěn)健的定量分析。它還提供了跨時間、空間和模態(tài)領域的通用分割與配準策略，支持可擴展且多功能的應用于廣泛的生物醫(yī)學數據集。

我們開發(fā)了一種定制的2.5D非剛性配準策略，該策略能夠在單個樣本與3D參考圖譜之間實現精確的全腦配準，從而促進了錨點階段圖譜的高效構建。與典型的基于3D深度學習的方法不同，我們的2.5D配準方法在不產生高昂計算成本的情況下實現了精確、高分辨率的3D配準。該策略易于擴展至更高分辨率的圖像，使其在多樣化的數據集中具有更廣泛的應用性。將其嵌入D-LMBmapX后，我們構建了七個錨點階段圖譜，并量化了出生后發(fā)育過程中267個腦區(qū)的體積變化。這揭示了各區(qū)域間高度多樣化和動態(tài)的增長模式（圖2），凸顯了亟需一種能夠穩(wěn)健地在任意時間點注冊發(fā)育中大腦的方法，以支持廣泛的神經發(fā)育研究。

然而，在每個發(fā)育階段實現全腦配準需要重復構建圖譜，涉及大量的樣本收集和細致的分割工作。除了繁重的工作量外，早期出生后階段引入了顯著的變異性——即使是在同齡樣本中——使得精確配準尤其具有挑戰(zhàn)性且易出錯。作為一種權宜之計，現有策略35通常依賴插值圖譜來填補未代表的時間點，但其背后假設的大腦成熟過程平滑線性的前提引入了重大局限性，并削弱了原始目標。大腦發(fā)育本質上是非線性和區(qū)域特異性的，不同的回路在不同的時間線上成熟，并在關鍵時期經歷快速的形態(tài)變化。對相鄰年齡模板進行線性變換和平均——而不考慮這些生物學動力學——可能會導致解剖學上不準確的插值圖譜，尤其是在經歷劇烈結構或位置變化的區(qū)域。此外，對整個大腦應用統(tǒng)一的變換無法捕捉不同區(qū)域異步發(fā)育的特點，可能扭曲關鍵的神經解剖學特征。這些局限性強調了基于真實樣本的數據驅動型圖譜構建的必要性，特別是在發(fā)育軌跡最發(fā)散的早期出生后階段。

D-LMBmapX通過使用戶能夠僅憑單一樣本及其相鄰錨點圖譜，自動構建任意給定出生后日期的推斷圖譜，從而應對了這一挑戰(zhàn)，賦予發(fā)育神經科學界一項基礎工具，使其能夠根據自身關鍵時間線研究感興趣的腦區(qū)，而非受制于圖譜的可用性。

對于介觀尺度環(huán)路剖面分析而言，全腦軸突和胞體分割通常是耗時最長的步驟。盡管我們此前已開發(fā)了D-LMBmap17，這是一個用于全腦環(huán)路剖面分析的自動化流程，大幅減少了對勞動密集型手動標注的需求，但它僅設計用于成年階段。直接將D-LMBmap17擴展至5D發(fā)育分析會面臨重大挑戰(zhàn)，因為發(fā)育過程中軸突和胞體形態(tài)存在顯著變異，這將要求擁有大量標注數據集并在每個出生后階段重新訓練模型。為克服這一難題，D-LMBmapX整合了CircuitFound，這是一個強大的基礎模型，能夠在海量腦圖像數據集上實現大規(guī)模自監(jiān)督預訓練。只需極少的樣本特異性微調，該框架即可實現跨發(fā)育階段的穩(wěn)健而精確的軸突和

胞體分割，為全面的腦繪圖提供了一個通用解決方案。

介觀尺度連接組學的快速進步由大規(guī)模3D成像技術（如LSFM）和多種高分辨率2D方法25–28共同推動。與此同時，對整合多模態(tài)、高通量空間數據集以捕捉大腦組織互補方面的日益增長的需求也不斷涌現。這些數據集包括空間轉錄組學、跨突觸示蹤、活動依賴性標記和功能成像等。然而，由于這些程序的復雜性，此類數據集通常僅限于少量經過處理的2D腦切片。現有的2D到3D配準方法通常需要多個連續(xù)切片，且受限于有限的分辨率52,53。在此背景下，D-LMBmapX代表著一項重大進展——其執(zhí)行跨模態(tài)和跨維度配準的能力，允許即使是單個2D切片也能在共同的3D參考框架內被精確對齊。這種集成能力不僅增強了介觀尺度環(huán)路剖面分析的可擴展性，也為構建一個融合解剖、分子、生理和功能數據的統(tǒng)一介觀尺度連接組學生態(tài)系統(tǒng)奠定了基礎。

前腦TH+環(huán)路主要由多巴胺能和去甲腎上腺素能系統(tǒng)組成，這兩個關鍵的神經調節(jié)系統(tǒng)參與廣泛的功能，包括獎賞、動機、注意力和情緒調節(jié)。這些系統(tǒng)中的發(fā)育缺陷長期以來被認為與多種精神障礙的易感性有關54,55。通過使用D-LMBmapX，我們生成了首個覆蓋出生后發(fā)育過程中260多個腦區(qū)的TH+軸突支配的5D全腦圖譜。雖然紋狀體從P0起就接受極其密集的支配，且當前成像分辨率下無法在軸突水平進行分割，但我們通過強度對其區(qū)域密度進行了量化，以確保全面覆蓋。在皮質區(qū)域，TH+軸突密度隨時間穩(wěn)步增加，這與青春期期間前額葉皮層投射的多巴胺能軸突持續(xù)生長和路徑形成報告一致56。相比之下，其他區(qū)域表現出多樣的時空動態(tài)，包括急劇的發(fā)育激增、瞬時峰值（例如，PVH和BST），或無法歸因于腦體積變化的漸進性下降——這些模式與多巴胺支配系統(tǒng)層面精細化的證據相符57。我們的圖譜為這些系統(tǒng)提供了全腦范圍的發(fā)育參考，并為探索區(qū)域特異性支配軌跡如何與神經發(fā)育和心理健康狀況的脆弱窗口相關聯奠定了基礎。對TH+軸突的成功全腦剖面分析凸顯了D-LMBmapX作為一個有效的端到端工作流在介觀尺度環(huán)路分析中的作用，能夠實現精確的解剖映射、發(fā)育軌跡追蹤和跨研究比較。

D-LMBmapX標志著從靜態(tài)映射向動態(tài)、綜合腦繪圖的轉變，實現了對不同神經環(huán)路和神經發(fā)育障礙發(fā)育組裝的自動化、精確分析。除發(fā)育中的小鼠大腦外，它還提供了一種強大且可推廣的5D策略，用于通過整合空間、時間和多組學分析來研究生長、衰老和疾病。

原文鏈接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.02.25.639766v2.full.pdf