近年來(lái)，環(huán)肽因其卓越的高親和性、優(yōu)異的代謝穩(wěn)定性及其在靶向“難成藥”靶點(diǎn)方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，逐漸成為藥物研發(fā)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。噬菌體展示技術(shù)作為一種高效、便捷的篩選平臺(tái)，已被廣泛應(yīng)用于肽類候選分子的發(fā)現(xiàn)。然而，如何在噬菌體展示平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)高效的環(huán)肽文庫(kù)構(gòu)建與功能篩選，仍然面臨著顯著的挑戰(zhàn)。為克服這一瓶頸，亟需發(fā)展一種反應(yīng)操作簡(jiǎn)便、生物相容性良好、底物適用性廣泛且能夠提供精確位點(diǎn)選擇性的環(huán)化策略，以推動(dòng)環(huán)肽藥物的高效發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用。

蘭州大學(xué)雷新響教授課題組近年來(lái)致力于針對(duì)潛在藥用靶點(diǎn)發(fā)掘活性環(huán)肽的研究，并在噬菌體展示多肽篩選領(lǐng)域開(kāi)展了相關(guān)探索，成功地將化學(xué)成環(huán)策略（以鄰苯二甲醛與異硫氰酸酯為主導(dǎo)）及酶催化成環(huán)策略應(yīng)用于噬菌體展示平臺(tái)上（

New. J. Chem.

Chem. Sci.

ChemRxiv.

. Am. Chem. Soc.

傳統(tǒng)的雙環(huán)肽構(gòu)建方法，如TBMB、TBAB和TATA，常因與親核性殘基發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性副反應(yīng)，導(dǎo)致反應(yīng)效率下降、色譜分離困難，且在生物環(huán)境中的兼容性有限。基于鉍(III)的策略因其通過(guò)選擇性配位與三個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)合來(lái)提高肽的穩(wěn)定性和結(jié)合親和力而受到關(guān)注，但仍依賴外部金屬鹽，并且配位鍵的動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定性在復(fù)雜環(huán)境中可能面臨一定挑戰(zhàn)。巰基–烯烴光點(diǎn)擊化學(xué)（Thiol-Ene Photoclick Chemistry）策略結(jié)合了點(diǎn)擊化學(xué)的核心優(yōu)點(diǎn)——快速、高效和操作簡(jiǎn)便，同時(shí)具備光激活的獨(dú)特特性，能夠精確調(diào)控反應(yīng)的空間和時(shí)間。這些獨(dú)到的特性使其在雙環(huán)肽、噬菌體展示雙環(huán)肽文庫(kù)的構(gòu)建和疾病靶標(biāo)活性環(huán)肽篩選中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

圖1. 環(huán)肽雙環(huán)化策略（圖片來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

作者首先利用TAIC和N-乙?；?L-半胱氨酸酯作為模型底物，通過(guò)一系列條件優(yōu)化，確定了最佳反應(yīng)條件，并將其拓展到線性多肽的雙環(huán)化上。該反應(yīng)能夠在不同pH條件及不同緩沖鹽溶液中有效進(jìn)行，與傳統(tǒng)的TBMB環(huán)化方法相比，巰基–烯烴光點(diǎn)擊化學(xué)的環(huán)化策略更為高效，僅產(chǎn)生少量由連接子及光引發(fā)劑引起的雜質(zhì)。此外，作者還將此策略拓展至一系列無(wú)保護(hù)的線性多肽肽鏈，驗(yàn)證了該環(huán)化策略在簡(jiǎn)便性和穩(wěn)健性方面的優(yōu)越性。

圖2. 模型肽上的環(huán)化（圖片來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

圖3. 環(huán)化底物拓展（圖片來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

隨后，作者將這一方法應(yīng)用于噬菌體展示相關(guān)實(shí)驗(yàn)中。首先，通過(guò)MALDI-TOF MS驗(yàn)證了在表達(dá)的融合pIII蛋白上進(jìn)行的環(huán)化反應(yīng)的可靠性。接著，構(gòu)建了一個(gè)包含十個(gè)隨機(jī)氨基酸（CX5CX5C）的噬菌體展示線性肽文庫(kù)，并利用巰基–烯烴光點(diǎn)擊化學(xué)進(jìn)行了環(huán)化。針對(duì)疾病相關(guān)靶標(biāo)蛋白CypA，作者進(jìn)行了多輪淘洗，最終通過(guò)二代測(cè)序得到了富集的多肽序列。隨后，利用表面等離子共振（SPR）和生物膜層干涉（BLI）技術(shù)，對(duì)富集的兩條線性多肽及其環(huán)肽的親和力進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，環(huán)肽CM1相比線肽M1，具有顯著提高的結(jié)合親和力，達(dá)到364 ± 70 nM，并且展現(xiàn)了較好的穩(wěn)定性，半衰期為463分鐘。為了進(jìn)一步探究CM1與CypA的相互作用，作者使用了15N標(biāo)記的CypA進(jìn)行1H-15N-HSQC NMR滴定實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示CM1結(jié)合于CypA的活性口袋。這些結(jié)果突出了巰基–烯烴光點(diǎn)擊化學(xué)構(gòu)建的雙環(huán)肽在高效且選擇性靶向治療相關(guān)蛋白方面的潛力。

圖4. 巰基–烯烴光點(diǎn)擊化學(xué)的應(yīng)用（圖片來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

總結(jié)

本研究首次報(bào)道了光化學(xué)策略應(yīng)用于自由肽和噬菌體展示無(wú)保護(hù)肽的雙環(huán)化。與傳統(tǒng)的TBMB介導(dǎo)的烷基化方法相比，巰基–烯烴光點(diǎn)擊化學(xué)方法在效率、選擇性和控制性方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，同時(shí)能最小化篩選過(guò)程中的假陽(yáng)性。該方法操作簡(jiǎn)便、可擴(kuò)展，并且與生物系統(tǒng)兼容，使其成為生成多樣化肽庫(kù)和發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)性蛋白靶標(biāo)及蛋白–蛋白相互作用（PPIs）配體的有力平臺(tái)?？傮w而言，本研究突顯了巰基–烯烴光點(diǎn)擊化學(xué)在擴(kuò)展多肽藥物化學(xué)生物學(xué)工具箱方面的巨大潛力。

相關(guān)工作發(fā)表在

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（歡迎加入雷新響教授課題組攻讀碩士、博士研究生或者從事博士后課題合作探索。平臺(tái)擁有完善的分子生物學(xué)技術(shù)條件、有機(jī)合成設(shè)施及800 MHz核磁共振，島津MALDI-TOF（7090）等實(shí)驗(yàn)條件。請(qǐng)有意者發(fā)送簡(jiǎn)歷和研究小結(jié)至leixx@lzu.edu.cn。）

作者簡(jiǎn)介

通訊作者 雷新響

雷新響，男，博士生導(dǎo)師，藥物化學(xué)專業(yè)，博士，現(xiàn)為蘭州大學(xué)萃英特聘三級(jí)教授。畢業(yè)于中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，曾于2010-2011年在耶魯大學(xué)從事mRNA與蛋白質(zhì)相互作用研究工作。曾任中南民族大學(xué)藥學(xué)院副院長(zhǎng)和民族藥學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心主任。從事基于核磁共振波譜技術(shù)的藥物分析、天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定、活性篩選等研究工作?，F(xiàn)講授波譜分析，曾講授化學(xué)生物學(xué)、生物化學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、藥事管理學(xué)等課程，主持國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目及國(guó)際合作等項(xiàng)目。以通訊作者或第一作者在JACS，《德國(guó)應(yīng)用化學(xué)》，《核酸研究》，ACS Nano，ACS Catalysis，Chemical Science，Analytical Chemistry，Organic Letters，Chemical Communication,《歐洲化學(xué)》，《磁共振化學(xué)》等期刊上發(fā)表系列SCI論文。任《Natural Products and Bioprospecting》編委；《Magnetic Resonance Letters》編委。現(xiàn)任中國(guó)化學(xué)會(huì)有機(jī)分析專業(yè)委員會(huì)委員，湖北省藥學(xué)會(huì)理事，湖北省晶體學(xué)會(huì)理事，組織了多次國(guó)際學(xué)術(shù)會(huì)議，在全國(guó)性和國(guó)際性學(xué)術(shù)會(huì)議上做報(bào)告40余次，被Nature，德國(guó)應(yīng)用化學(xué)，Nature Communications等期刊邀請(qǐng)為審稿人。

第一作者

明巍 蘭州大學(xué) 博士研究生 藥物化學(xué)生物學(xué)方向

楊小琴 蘭州大學(xué) 博士研究生 藥物化學(xué)生物學(xué)方向