CD31- 染色體異倍體循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTC (circulating tumor cell) 是指從腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落入血的腫瘤細(xì)胞。與之相似，美國(guó)哈佛大學(xué)Klagsbrun團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道的存在于腫瘤組織血管壁上的CD31+ 異倍體腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞TEC (tumor endothelial cell)[1] 也可脫落入血形成“循環(huán)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞”CTEC[2]。由外周血轉(zhuǎn)運(yùn)的CTC、CTEC與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。此過程中，這些細(xì)胞相互之間可形成各種細(xì)胞團(tuán)，使其腫瘤轉(zhuǎn)移能力比單個(gè)細(xì)胞高出25-50倍。此外，血液中游離的CTC或CTEC也可與其它非轉(zhuǎn)移性細(xì)胞相結(jié)合，如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、NK細(xì)胞、血小板等，它們的作用可促進(jìn)或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[3]。

隨著CTC檢測(cè)技術(shù)不斷更新迭代，CTC、CTEC在指導(dǎo)免疫治療、檢測(cè)細(xì)胞型微小殘留病灶 (cellular MRD)、評(píng)估腫瘤異質(zhì)性、揭示腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)理等方面的核心作用近來受到人們?nèi)找鎻V泛的密切關(guān)注。最近，美國(guó)哈佛大學(xué)Haber團(tuán)隊(duì)就這一熱點(diǎn)領(lǐng)域的現(xiàn)狀與展望發(fā)表了他們的深入探討[3]。根據(jù)文章要點(diǎn)，現(xiàn)將文中CTC檢測(cè)、CTC、CTEC 2.0臨床應(yīng)用的發(fā)展趨勢(shì)與研究方向、同時(shí)結(jié)合本文尚未涉及的一些最新進(jìn)展做一簡(jiǎn)單介紹。

CTC檢測(cè)

CTC檢測(cè)由分離和鑒別兩個(gè)部分組成。早期的CTC分離技術(shù)主要基于CTC表面EpCAM的表達(dá)直接捕獲腫瘤細(xì)胞 (釣魚法)。然而相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，EpCAM在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)呈現(xiàn)極高異質(zhì)性，下圖中的免疫熒光染色和流式細(xì)胞分析顯示，相對(duì)于乳腺癌和腸癌EpCAM的高表達(dá)，肺癌、胰腺癌、膀胱癌、黑色素瘤腫瘤細(xì)胞均伴有極低的EpCAM表達(dá)。有報(bào)道指出，在134種上皮來源的腫瘤組織中，高達(dá)30% 的腫瘤上皮細(xì)胞根本不表達(dá)EpCAM[4]。此外，上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程 (EMT) 是CTC形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，此階段EpCAM也會(huì)降解。以非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC) CTC為例, 高達(dá)70% 的CTC為具有重要臨床意義的EpCAM-/Vimentin- 雙陰性異倍體裸細(xì)胞 (null cell)[5]。這些疊加因素嚴(yán)重制約了依賴EpCAM表達(dá)的泛癌種CTC檢測(cè)。迄今為止，依賴EpCAM的CTC捕獲檢測(cè)技術(shù)只適于FDA認(rèn)證的腸癌、乳腺癌及前列腺癌三種腫瘤。

當(dāng)人們?cè)噲D用細(xì)胞過濾法去除白細(xì)胞以便富集CTC時(shí) (size selection)，發(fā)現(xiàn)不少CTC與白細(xì)胞大小相當(dāng)，細(xì)胞尺寸高度重疊 (下圖)，因而此方法在去除白細(xì)胞的同時(shí)會(huì)丟失顯著數(shù)量的小細(xì)胞CTC[3]。目前已有報(bào)道，重要的間質(zhì)化CTC及70%的肝癌CTC均為小細(xì)胞[6]。

CTC的鑒別技術(shù)大都使用角蛋白 (CK) 抗體染色或核酸雜交，但這種依賴單一要素的鑒別技術(shù)有很大的局限性。世界著名的美國(guó)安德森癌癥中心 (MD Anderson) 報(bào)道了他們的研究成果，如圖所示，類似EpCAM在CTC中的低表達(dá)或不表達(dá)，很多CTC同樣呈現(xiàn)角蛋白CK不表達(dá)，從而導(dǎo)致CTC檢出的假陰性，這些CK- CTC 可以用HER2基因探針或染色體熒光原位雜交 (FISH) 方法進(jìn)行識(shí)別[7]。雖然各種廠家的CTC檢測(cè)技術(shù)不斷出現(xiàn) (文章中有詳細(xì)描述，此處不再贅述)[3]，但大部分還是圍繞細(xì)胞三要素的核酸、蛋白、細(xì)胞形態(tài) (大小、細(xì)胞團(tuán)) 中的單一要素進(jìn)行局部?jī)?yōu)化，并沒有實(shí)質(zhì)性改進(jìn)，致使CTC檢測(cè)的靈敏度及臨床應(yīng)用仍有很大局限性。例如，HER2基因擴(kuò)增被用來鑒別包括CTC在內(nèi)的HER2+ 腫瘤細(xì)胞，并用于指導(dǎo)抗HER2治療，但DNA經(jīng)mRNA產(chǎn)生具有生物學(xué)功能蛋白質(zhì)的過程中，受轉(zhuǎn)錄、翻譯環(huán)節(jié)的調(diào)控，DNA擴(kuò)增并不會(huì)必然導(dǎo)致相關(guān)蛋白的表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)有些乳腺癌病理組織標(biāo)本或腫瘤細(xì)胞系雖然存在HER2 基因擴(kuò)增，但并無HER2蛋白表達(dá)，即DNA ≠ mRNA ≠ 蛋白質(zhì)，對(duì)這類患者使用赫賽汀抗HER2治療無效[8]。因此，針對(duì)細(xì)胞三要素中的單一要素進(jìn)行檢測(cè)勢(shì)必會(huì)帶來以偏概全的誤判。

為了避免盲人摸象的局限性，有必要兼顧細(xì)胞三要素，對(duì)CTC進(jìn)行三位一體的全方位綜合檢測(cè)。為此，賽特生物 (www.cytointelligen.com) 和國(guó)內(nèi)外多家著名醫(yī)學(xué)院校經(jīng)過多年合作，開發(fā)出了不依賴EpCAM及細(xì)胞大小的非血源性細(xì)胞富集技術(shù) (SE, subtraction enrichment) 和相應(yīng)的“多重免疫熒光蛋白染色-染色體熒光原位雜交整合技術(shù)”(i?FISH)[9]，其中使用了USFDA認(rèn)證的實(shí)體腫瘤通用標(biāo)志物8號(hào)染色體異倍體的檢測(cè)試劑CEP8作為FISH探針。

如圖所示，單一的免疫熒光染色 (IF) 或染色體熒光原位雜交 (FISH) ，分別檢測(cè)出2個(gè)腫瘤細(xì)胞，而整合的IF+FISH (i?FISH) 卻可檢出3個(gè)腫瘤細(xì)胞，展現(xiàn)出了“1+1>2”的特殊技術(shù)優(yōu)勢(shì)。研究人員利用SE-i?FISH首次證實(shí)腫瘤組織中具有抑制機(jī)體免疫功能的CD31+ 異倍體腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞TEC[10,11] 也會(huì)以CTEC的形式廣泛存在于各種腫瘤患者的外周血循環(huán)中[2]。現(xiàn)已證實(shí)，TEC、CTEC來自于腫瘤細(xì)胞TC，“腫瘤細(xì)胞血管內(nèi)皮化”及“血管內(nèi)皮細(xì)胞腫瘤化”構(gòu)成了TEC形成的主要機(jī)制，過程中包括了TC與正常血管內(nèi)皮細(xì)胞EC相融合，或低氧環(huán)境下TC的最終轉(zhuǎn)分化 (transdifferentiation)[12]。TEC、CTEC兼具了腫瘤細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞造血管的雙重特性。利用衍生的SE-i?FISH(NC) (壞死細(xì)胞NC, necrotic cell) 技術(shù)可進(jìn)一步有效區(qū)分，并同步、原位檢測(cè)對(duì)治療敏感 (壞死) 或耐受 (活性) 的各種CD31- CTC、CD31+ CTEC亞類細(xì)胞[13]。該技術(shù)以其獨(dú)特的創(chuàng)新性被“科學(xué)”雜志特別報(bào)道 (Life Sci Tech Sect 2013, Science 341)，同時(shí)也被國(guó)際著名“分子腫瘤學(xué)”雜志 (Mol Oncol，F(xiàn)EBS press) 以封面形式向全球讀者做了專題介紹[5]。

隨著各種技術(shù)不斷發(fā)展，CTC、CTEC檢測(cè)已不再局限于對(duì)血液樣本的簡(jiǎn)單細(xì)胞計(jì)數(shù)，而是擴(kuò)展到對(duì)其它多種生物體液 (如胸腹水、骨髓、尿液、腦脊液、灌洗液等) 中的播散性腫瘤細(xì)胞DTC、DTEC[14-16] 以及腫瘤組織中的各類細(xì)胞的多維度指標(biāo)檢測(cè)。根據(jù)SE-i?FISH或SE-i?FISH(NC) 檢測(cè)出的多項(xiàng)綜合指標(biāo)，包括與腫瘤細(xì)胞惡性度密切相關(guān)的染色體倍體數(shù)目 (擴(kuò)增或缺失)[17,18]、多種腫瘤標(biāo)志物蛋白是否表達(dá)、細(xì)胞形態(tài) (大小、細(xì)胞團(tuán)等) 及細(xì)胞活性或壞死狀態(tài)等，可將這些細(xì)胞進(jìn)行亞類分型，每種亞類細(xì)胞各自分別具有不同的重要臨床意義。與此同時(shí)，SE-i?FISH可將被比喻為“羊”的脫落于正常血管內(nèi)皮組織的“循環(huán)血管內(nèi)皮細(xì)胞”CEC (CD31+，二倍體) 與“披著羊皮的狼”的“循環(huán)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞”CTEC (CD31+，異倍體) 進(jìn)行有效區(qū)分，避免了檢測(cè)過程中CEC對(duì)CTEC的干擾，有助于更加客觀、準(zhǔn)確評(píng)估CTEC的臨床意義。

有別于小片段“核酸型循環(huán)腫瘤標(biāo)志物”ctDNA, 作為一對(duì)伴隨腫瘤進(jìn)展、實(shí)時(shí)攜帶細(xì)胞三要素 (完整核酸信息、瘤標(biāo)蛋白表達(dá)、細(xì)胞形態(tài)及活性狀態(tài)) 的“細(xì)胞型循環(huán)腫瘤標(biāo)志物”，CTC、CTEC在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等過程中相互協(xié)調(diào)、相互作用。

SE-i?FISH、SE-i?FISH(NC) 已被廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的臨床、基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究。現(xiàn)已證實(shí)，胃癌三倍體 (trisomy 8) CTC對(duì)一線化療藥物順鉑內(nèi)源性耐藥[19]。非小細(xì)胞肺癌PD-L1+ CTC對(duì)免疫治療敏感，但PD-L1+ CTEC則對(duì)免疫治療藥物Opdivo致敏的T細(xì)胞耐受，并與患者較差預(yù)后密切相關(guān)；依據(jù)倍體不同，PD-L1+ 多倍體 (≥pentasomy 8) 、三倍體CTEC分別具有對(duì)O藥內(nèi)源性和繼發(fā)性耐藥特征[20]，此點(diǎn)與已報(bào)道的腫瘤組織中的TEC抑制機(jī)體免疫功能 (包括淋巴細(xì)胞功能) 相一致[10,11]，但該研究對(duì)細(xì)胞的精確鎖定已精準(zhǔn)到單細(xì)胞的染色體及蛋白表達(dá)層面[20]。經(jīng)過失巢凋亡、血流剪應(yīng)力、血中免疫細(xì)胞攻擊等多重選擇性淘汰后，適者生存的CTC表面腫瘤標(biāo)志物 (如HER2) 表達(dá)可以與原發(fā)灶完全不同[21]。北京大學(xué)腫瘤中心沈琳主任團(tuán)隊(duì)在全球首次報(bào)道了應(yīng)用SE-i?FISH可在高達(dá)76%的102例胃癌組織HER2- 患者中動(dòng)態(tài)檢測(cè)出HER2+ CTC，并成功據(jù)此指導(dǎo)抗HER2靶向治療[22]。此外，通過SE-i?FISH檢測(cè)不同亞類CTC、CTEC，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院張同梅主任團(tuán)隊(duì)報(bào)道了在排除CEC干擾的前提下，可有效預(yù)測(cè)并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)抗血管生成藥物貝伐單抗對(duì)NSCLC的療效[5]；解放軍301總醫(yī)院肝膽中心/清華大學(xué)長(zhǎng)庚醫(yī)院董家鴻院士團(tuán)隊(duì)、北京協(xié)和醫(yī)院外科戴夢(mèng)華主任團(tuán)隊(duì)分別鎖定了肝癌、胰腺癌患者手術(shù)后升高并與復(fù)發(fā)密切相關(guān)的干細(xì)胞性CTC 及CD44v6+ 干性CTEC亞類細(xì)胞類型[6,23]。上海復(fù)旦腫瘤醫(yī)院王紅霞主任團(tuán)隊(duì)利用此技術(shù)揭示了在乳腺癌肺轉(zhuǎn)移過程中起決定性作用的CTC亞類細(xì)胞及其作用原理[24]。

鑒于SE-i?FISH應(yīng)用于臨床檢測(cè)CTC、CTEC日益普及，由北京大學(xué)人民醫(yī)院王建六、昌曉紅教授牽頭發(fā)起、匯集國(guó)內(nèi)多家一流醫(yī)院共同制定的CTC/CTEC檢測(cè)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)已由 “中國(guó)研究型醫(yī)院學(xué)會(huì)” 在“全國(guó)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)信息平臺(tái)”上正式發(fā)布 (T/CRHA 163—2025)。

展望：CTC、CTEC 2.0的臨床應(yīng)用及i?FISH精準(zhǔn)靶向單細(xì)胞多組學(xué)研究

一、臨床應(yīng)用展望

目前CTC 1.0的臨床應(yīng)用主要集中在療效評(píng)估、耐藥監(jiān)測(cè)及確診由腫瘤轉(zhuǎn)移介導(dǎo)的遠(yuǎn)端復(fù)發(fā)，CTC數(shù)量在這些應(yīng)用場(chǎng)景中一般較高。

Haber團(tuán)隊(duì)在圖中展示了隨著CTC檢測(cè)靈敏度、特異性的不斷提升，相對(duì)于假陽(yáng)性率較高且無法定位組織來源的ctDNA檢測(cè)[3]，今后微量CTC、CTEC 2.0檢測(cè)的臨床應(yīng)用將在1.0的基礎(chǔ)上進(jìn)一步擴(kuò)展到兩個(gè)方面，1) 在患者毫無癥狀、影像學(xué)尚未發(fā)現(xiàn)原發(fā)灶形成的腫瘤超早期階段，進(jìn)行細(xì)胞層面的腫瘤早診與早篩。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院、國(guó)家癌癥中心赫捷院士、院長(zhǎng)團(tuán)隊(duì)已率先報(bào)道了利用SE-i?FISH聯(lián)合檢測(cè)CTC、CTEC在區(qū)分良、惡性肺小結(jié)節(jié)及肺癌早診過程中具有重要臨床意義[25]；2) 檢測(cè)手術(shù)后腫瘤灶周邊 (切緣) 殘留的MRD腫瘤細(xì)胞TC、TEC及術(shù)后外周血中的MRD CTC、CTEC，并根據(jù)這些術(shù)后組織、血中殘留的MRD 細(xì)胞指導(dǎo)術(shù)后輔助治療 (adjuvant therapy)、評(píng)估療效及預(yù)后。其中，病理組織中具有播散能力的腫瘤細(xì)胞在圖中被反復(fù)描述，提示如何有效檢測(cè)這類殘留于組織中 (如手術(shù)切緣部位) 的惡性細(xì)胞具有重要的臨床價(jià)值[3]。這些藏匿于被病理學(xué)診斷為正常組織中的、具有正常細(xì)胞形態(tài)的惡性細(xì)胞被定義為“癌變細(xì)胞” (cancerized cells)，它們與具有異常細(xì)胞形態(tài)的“癌細(xì)胞” (cancer cell) 不同，常規(guī)病理學(xué)檢查無法識(shí)別這類癌變細(xì)胞[26]。美國(guó)安德森 (MD Anderson) 癌癥分子病理診斷中心報(bào)道了染色體異倍體和基因突變是組織中“癌變細(xì)胞”的主要分子特征[27]。

Haber團(tuán)隊(duì)對(duì)于CTC今后應(yīng)用前景的展望與廣州南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院何仁亮主任團(tuán)隊(duì)與賽特生物去年就已首次聯(lián)合報(bào)道的研究方向及成果相一致[28]。在這項(xiàng)基于“i?FISH腫瘤組織與液體雙相定量活檢”的臨床實(shí)驗(yàn)研究中，研究人員針對(duì)惡性黑色素瘤患者沿著“診斷-手術(shù)-動(dòng)態(tài)評(píng)估免疫治療療效-檢測(cè)細(xì)胞型MRD”時(shí)間軸線，利用賽特6-通道Ki67/Vimentin、PD-L1/p16 、PD-L1/Ki67、PD-L1/NC-i?FISH對(duì)腫瘤原發(fā)灶、切緣、前哨淋巴結(jié)中的TC、TEC、術(shù)后免疫治療過程中不同階段的CTC、CTEC，以及12程治療結(jié)束后的MRD CTC、CTEC分別進(jìn)行了系統(tǒng)性檢測(cè)與動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)[28]。

除定量檢測(cè)各亞類細(xì)胞數(shù)目外，該研究首次可視性、全方位展示了位于不同部位的各種TC、TEC、CTC、CTEC亞類細(xì)胞的組成比例、8號(hào)染色體 (Chr8) 的倍體分布、不同瘤標(biāo)表達(dá)率以及大、小細(xì)胞比例等。值得密切關(guān)注的是，此項(xiàng)研究首次發(fā)現(xiàn)了根據(jù)病理學(xué)細(xì)胞形態(tài)檢查定義的 “2 cm常規(guī)安全性切緣”實(shí)際富含顯著數(shù)量的異倍體“癌變細(xì)胞”TC (CD31-) 及TEC (CD31+)，它們構(gòu)成了病理學(xué)檢查無法判斷的“癌變切緣”(CEM, cancerized excision margin)[26-28]。首次報(bào)道的“癌變切緣”[28] 也在其它多瘤種、多中心臨床實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí)。此項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)，與原發(fā)灶和外周血中各類細(xì)胞展示的高異質(zhì)性不同，該黑色素瘤患者“癌變切緣”殘留的MRD細(xì)胞以TC為主 (97%)，而轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中則以TEC為主 (80%)，但這些處于兩個(gè)完全不同部位的幾乎所有TC、TEC均為8號(hào)染色體缺失 (單體) 且PD-L1+ 表達(dá)。這些深度分析對(duì)揭示“癌變切緣”與術(shù)后升高的MRD CTC、CTEC之間的相關(guān)性、如何根據(jù)量化的細(xì)胞型MRD TC、TEC、CTC、CTEC的不同數(shù)量有效指導(dǎo)腫瘤術(shù)后輔助治療，以及解析各類細(xì)胞在腫瘤轉(zhuǎn)移、進(jìn)展、復(fù)發(fā)過程中如何相互作用，從不同視野提供了多層面的新穎獨(dú)特且可靠的技術(shù)手段與依據(jù)。

此外，Haber團(tuán)隊(duì)沒有提及的利用CTC、CTEC評(píng)估術(shù)前新輔助化療 (neoadjuvant therapy) 療效也是今后值得密切關(guān)注的一個(gè)方向，江蘇省人民醫(yī)院乳腺癌中心已報(bào)道了他們?cè)诖祟I(lǐng)域利用SE-i?FISH技術(shù)取得的開創(chuàng)性先期成果[29]。

二、CTC、CTEC精準(zhǔn)靶向單細(xì)胞多模態(tài)研究

目前幾乎所有單細(xì)胞測(cè)序在樣本制備時(shí)，研究人員對(duì)每一個(gè)受檢單細(xì)胞的詳細(xì)生物學(xué)性狀及其臨床意義，包括染色體倍體數(shù)目、瘤標(biāo)表達(dá)、CD31表達(dá)、細(xì)胞形態(tài)、對(duì)藥物敏感或耐受的凋亡狀態(tài)等并不充分了解，只是不加區(qū)分地單純分離個(gè)體細(xì)胞進(jìn)行高通量測(cè)序，這類混合檢測(cè)的方式也被稱之為“盲測(cè)”，這當(dāng)中的局限性已引起人們的高度重視[10]。如果能在排除非目的細(xì)胞干擾的前提下，有針對(duì)性地對(duì)具有明確生物學(xué)及臨床意義的各個(gè)目的細(xì)胞特異性開展精準(zhǔn)單細(xì)胞分析，勢(shì)必會(huì)為人們提供更加準(zhǔn)確、完整的生物信息。

大量臨床實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，i?FISH可在不同來源的腫瘤組織或血液樣本中有效檢測(cè)并鎖定具有不同臨床意義的TC、TEC、CTC、CTEC各亞類細(xì)胞。利用賽特生物聯(lián)合開發(fā)的“i?FISH? 固/液雙相單細(xì)胞非激光顯微分離系統(tǒng)”(n-MSM, non-laser microscopic single cell manipulator)，讀取與之匹配的“i?FISH? CTC 6-通道3D圖像掃描與分析系統(tǒng)”記錄的靶細(xì)胞定位坐標(biāo)，根據(jù)研究目的，逐一特異性挑取待檢靶細(xì)胞，可以避開并杜絕不相關(guān)細(xì)胞對(duì)后續(xù)檢測(cè)與分析的干擾。相對(duì)于較常用的、只適于固態(tài)工作環(huán)境的激光捕獲顯微切割技術(shù) (LCM), n-MSM展示了明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)：1) 可在固態(tài)和液態(tài)兩種環(huán)境下挑取完整靶細(xì)胞供后續(xù)各種分析 (包括轉(zhuǎn)錄組分析)；2) 操作過程中不存在因激光高溫、標(biāo)本干燥引起的mRNA降解或蛋白變性；3) 避免了取樣過程中丟失因激光切割而產(chǎn)生的細(xì)胞碎片，從而確保了每個(gè)待檢細(xì)胞所有生物信息的完整性。

1. i?FISH靶向單細(xì)胞全外顯子測(cè)序 (targeted scWES) – 藥敏壞死細(xì)胞vs 耐藥活性細(xì)胞

如期進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)顯示，利用SE-i?FISH(NC)可精確識(shí)別、區(qū)分檢測(cè)同一NSCLC患者體內(nèi)對(duì)治療敏感的壞死PD-L1+ 四倍體小細(xì)胞CTC (necrotic CD31-SCTCtetra)、壞死PD-L1+ 多倍體大細(xì)胞CTEC (necrotic CD31+LCTECmulti) 及對(duì)治療耐藥的活性PD-L1+ 三倍體小細(xì)胞CTC (viable CD31-SCTCtri) 及活性PD-L1+多倍體大細(xì)胞CTEC (viable CD31+LCTECmulti)。針對(duì)n-MSM挑取的各個(gè)單細(xì)胞分別開展單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增 (scWGA) 及全外顯子測(cè)序 (scWES) 顯示，與治療藥物相關(guān)的EGFR、BRCA1、PTEN基因突變只在對(duì)治療藥物敏感的壞死CTC及CTEC中檢測(cè)到，而耐藥的活細(xì)胞中沒有檢測(cè)出與治療藥物相關(guān)的基因突變。

此檢測(cè)及挑取技術(shù)在其它瘤種的研究中幫助人們揭示了治療后的小細(xì)胞肺癌 (SCLC) 患者在腫瘤進(jìn)展時(shí)，其骨髓內(nèi)的DTC 僅與治療前的外周血CTC共享更多的同源性體細(xì)胞基因突變[14]；闡明了大、小不同的胃癌CTC具有不同的耐藥機(jī)制，其中MET/PI3K/AKT 通路和SMARCB1 介導(dǎo)的染色質(zhì)重塑、K-Ras/Rap1信號(hào)傳導(dǎo)通路，分別在大、小CTC耐藥過程中發(fā)揮著重要作用[30]。

2. 基于i?FISH靶向單細(xì)胞質(zhì)譜的CTC、CTEC精準(zhǔn)單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué) (targeted scProteomics，tSCP)

相對(duì)于遺傳信息源頭DNA (基因組學(xué)) 及中間橋梁mRNA (轉(zhuǎn)錄組學(xué))，蛋白質(zhì)才是最終直接實(shí)現(xiàn)一系列生物學(xué)功能的關(guān)鍵物質(zhì)，能實(shí)時(shí)反應(yīng)機(jī)體或細(xì)胞的病理或生理狀態(tài)。受轉(zhuǎn)錄與翻譯兩個(gè)主要環(huán)節(jié)的復(fù)雜調(diào)控，某些“細(xì)胞中心法則”的生物鏈可發(fā)生斷裂，致使DNA、mRNA、蛋白質(zhì)之間并不存在必然的前后因果關(guān)系，即DNA ≠ mRNA ≠ 蛋白質(zhì)，因此單純的基因組、轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)并不能如實(shí)反應(yīng)蛋白質(zhì)層面的變化，而蛋白質(zhì)組學(xué)能在高度動(dòng)態(tài)變化的整體蛋白質(zhì)層面，從功能執(zhí)行、機(jī)制研究、臨床應(yīng)用等方面為人們探索腫瘤奧秘、尋找腫瘤新抗原、開發(fā)新的蛋白靶點(diǎn)藥物等方面提供更加直接與客觀的幫助。

近期報(bào)道的最新單細(xì)胞質(zhì)譜技術(shù)使得開展單細(xì)胞深度蛋白質(zhì)組學(xué)研究成為可能[31]。賽特生物、艾信博生物醫(yī)學(xué)和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院暨北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院系統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究所密切合作，將此最新單細(xì)胞質(zhì)譜技術(shù)與i?FISH靶向單細(xì)胞檢測(cè)及挑取技術(shù)相結(jié)合，針對(duì)同一腸癌患者體內(nèi)檢測(cè)出的四類細(xì)胞，包括PD-L1- CTC (組1)、PD-L1- CTEC (組2)、PD-L1+ CTC (組3) 及PD-L1+ CTEC (組4)，按平均每組2個(gè)細(xì)胞，逐個(gè)挑取目的單細(xì)胞，成功進(jìn)行了精準(zhǔn)靶向單細(xì)胞質(zhì)譜檢測(cè) (targeted scMass Spec)。如圖所示，蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，每個(gè)細(xì)胞可以檢測(cè)出2500個(gè)左右的蛋白，不同組間的細(xì)胞其蛋白表達(dá)有很大的異質(zhì)性，但同一組內(nèi)的細(xì)胞卻顯示蛋白表達(dá)具有很高的一致性，這些動(dòng)態(tài)檢測(cè)出的、伴隨腫瘤進(jìn)展的不同CTC、CTEC亞類細(xì)胞展現(xiàn)了獨(dú)特且鮮明的“組間高差異、組內(nèi)高一致”生物學(xué)特征，能夠清晰地被可視化、特異性、明確聚類?；趩渭?xì)胞質(zhì)譜的“i?FISH精準(zhǔn)靶向單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)”得到了可行性驗(yàn)證，為今后開展大樣本實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

隨著各種檢測(cè)技術(shù)不斷推陳出新，在鎖定并挑取具有明確生物學(xué)及臨床意義的靶向單細(xì)胞前提下，針對(duì)CTC、CTEC精準(zhǔn)開展以揭示執(zhí)行功能的蛋白質(zhì)組學(xué)研究 (proteomics) 為基礎(chǔ)，聯(lián)合可提供遺傳背景的DNA基因組 (genomics)、顯示基因表達(dá)趨勢(shì)的mRNA轉(zhuǎn)錄組 (transcriptomics)、展示最終產(chǎn)物與表型的代謝組 (metabolomics)，以及涵蓋細(xì)胞表觀遺傳修飾的表觀組 (epigenomics，如DNA甲基化、組蛋白修飾等)，將能夠幫助人們更加全面地深度解析腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、耐藥等機(jī)理，從而更加有效地助力腫瘤的預(yù)防與治療。

原文下載：http://www.cytointelligen.com/zlwz，第78R1篇文獻(xiàn)

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