鄭芝龍是福建省泉州府南安縣（今福建泉州南安）人，祖籍河南固始，曾遷莆田仙游楓亭。其父鄭士表為泉州府一小官吏，鄭芝龍為長子，生于1604年，下有四弟芝虎、芝麟、芝鳳、芝豹（這些名字都是后來起的）。明天啟元年（1621年)，由于家境困難，父親要17歲的鄭芝龍帶著兩個弟弟去投靠香山澳（今澳門）經(jīng)商的舅父黃程，作為學徒先從給葡萄牙人當“掮客”，也就是中介做起。明末的香山澳，已是安平商人（福建泉州安海港區(qū)的商人）聚集之地，如大商人顏一深、黃程，都是來自安海。鄭芝龍在此學習葡萄牙語，接觸各國的海商，學了不少做生意的本領(lǐng)。

為了取得外國商人的信任，鄭芝龍接受天主教的洗禮，教名為“尼古拉斯·加斯巴特”（Nicholas Gaspard），又稱為“尼古拉斯·一官·加斯巴特”，其中“尼古拉斯”是典型的西方名字，“一官”則是當時閩粵地區(qū)對長子的俗稱，“加斯巴特”可能是其受洗時所取的教名后綴。

不過，鄭芝龍一生信奉的宗教并非只有天主教，他還信奉海神媽祖、佛教的摩利支天菩薩以及日本神道八幡神等。

鄭芝龍在澳門的兩年，廣結(jié)各地外貿(mào)商人，包含時常往來于日本和澳門的大海商李旦。

李旦是17世紀中國東南沿海知名的海盜商人，為福建泉州人。他曾在菲律賓經(jīng)商，因與西班牙統(tǒng)治者不合，轉(zhuǎn)至日本九州島定居。李旦借由日本海盜集團幫助，籌組武裝船隊，在日本、中國大陸、臺灣、東南亞間與荷蘭、英國所經(jīng)營船只從事國際貿(mào)易往來，同時也從事海盜掠奪行為，因海上作風強悍，被西洋人取昵稱為“Captain China”（中國船長），或稱甲必丹李旦。

當時甲必丹李旦是王直之后較有海上勢力的人物，其商業(yè)觸角遠及蘇門答臘萬丹及菲律賓群島等地，1600年時已在馬尼拉閩南人社群中成為成功的商人，然而西班牙眼紅其財富抄其家并逮捕之，直到1607年才逃離西班牙人前往長崎和平戶并和當?shù)厝毡救思坝诉M行貿(mào)易。

天啟三年（1623年），鄭芝龍受舅舅黃程的委派，押運白糖、奇楠、麝香、鹿皮等貨物，搭上李旦的大船開往日本長崎平戶島，成為李旦的部下。因其能干可靠，被李旦“撫為義子”。李旦交給鄭芝龍一部分資產(chǎn)和船只讓他做生意，鄭芝龍也因此獲利頗豐。

在長崎，鄭芝龍得到日本女子田川氏的青睞并迎娶其為第二位妻子。

1624年初，鄭芝龍因李旦推薦，前往澎湖擔任荷蘭人的翻譯及通事，同年初秋荷蘭人撤退至臺灣南部；由于明朝和荷蘭的爭執(zhí)，影響到李旦當時的明朝、日本、臺灣島之間的商業(yè)利益，因此李旦派鄭芝龍去做荷蘭人的翻譯亦是李旦介入明朝和荷蘭的手段之一。

荷蘭人雖然給予這個“來自日本”的通事優(yōu)厚的待遇，但一開始并沒有重視鄭芝龍，直到后來荷蘭人發(fā)現(xiàn)可以利用鄭芝龍在臺灣海峽截擊前往馬尼拉的中國船只、削弱西班牙人（當時荷蘭人的主要競爭對手）的貿(mào)易實力。

荷蘭第二任大員長官杰拉德·弗雷德里克茲·德·韋特的信件中記載，其曾派“通事一官”（即鄭芝龍）率領(lǐng)約二十至三十艘中式帆船去執(zhí)行“截擊與俘獲”前往馬尼拉與西班牙人通商的中式帆船的任務。

鄭芝龍通過這種海盜行徑，一方面增強了自己的實力，另一方面也滿足了荷蘭人的利益需求，雙方在一定時期內(nèi)形成了相互利用的關(guān)系。

期間1624年8月27日（農(nóng)歷七月十四日）鄭芝龍妻子田川氏在日本平戶島千里濱產(chǎn)下兒子鄭成功。

為追求更大更自由的發(fā)展空間，大約在1625年4-5月間，鄭芝龍離開荷蘭人成為海上新興的獨立的亦商亦盜勢力。一名荷蘭船長寫給荷蘭長官馬蒂·孫克的信中提到其在海上遇到鄭芝龍：“（1625年4月）27日星期天，...首領(lǐng)一官，后面隨著手執(zhí)刀劍的銃手七八名，作為代表，向我們寒暄”。

天啟五年（公元1625年）七月十四日，李旦在平戶逝世。也有說法稱李旦是在1625年8月2日，從臺灣回平戶途中去世。

李旦臨終前將自己的商業(yè)網(wǎng)絡、武裝船隊及在臺灣的產(chǎn)業(yè)等核心勢力，盡數(shù)交給了義子鄭芝龍，鄭芝龍將部下分為十八先鋒，結(jié)為“十八芝”，以“芝”為號，可能是取其祥瑞、高貴之意，也是為了形成一個獨特的標識，增強團隊的凝聚力和辨識度。鄭芝龍亦同時將名字由俗稱“一官”改為“芝龍”，以顯示自己在這個聯(lián)盟中的首領(lǐng)地位，自此新的“海上霸主”誕生了，當時他21歲。