感染性骨缺損是骨科治療中的難題，常伴隨病原體感染、免疫微環(huán)境紊亂及骨再生障礙。當(dāng)前臨床手段如清創(chuàng)手術(shù)和長期抗生素治療雖能暫時(shí)控制感染，卻難以恢復(fù)免疫穩(wěn)態(tài)或營造促再生微環(huán)境；而傳統(tǒng)骨修復(fù)材料雖支持結(jié)構(gòu)重建，卻缺乏清除病原體和調(diào)控免疫的功能。這種治療策略上的局限常導(dǎo)致慢性炎癥、感染復(fù)發(fā)和骨再生失敗。近年來，骨免疫學(xué)研究強(qiáng)調(diào)免疫調(diào)節(jié)在骨愈合中的核心作用，尤其是巨噬細(xì)胞表型時(shí)序轉(zhuǎn)換對(duì)感染控制與組織再生的雙重調(diào)控，為開發(fā)新型免疫調(diào)節(jié)型生物材料提供了重要方向。

清華大學(xué)張洪杰院士、劉凱教授、萬思康博士和中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所劉雅薇副研究員、華東師范大學(xué)孫靜研究員聯(lián)合研發(fā)出一種時(shí)序免疫調(diào)節(jié)水凝膠（TIH），通過時(shí)序釋放Ca2?和Zn2?離子，精準(zhǔn)調(diào)控巨噬細(xì)胞從M1向M2表型轉(zhuǎn)變，從而實(shí)現(xiàn)感染控制與骨再生的協(xié)同促進(jìn)。該水凝膠由丙烯酸酯修飾的工程化蛋白與氧化海藻酸鈉通過Schiff堿和光交聯(lián)反應(yīng)快速形成，模擬細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，支持細(xì)胞黏附、血管生成和成骨分化。嵌入的鋅/鈣磷雜化納米顆?？蓪?shí)現(xiàn)Ca2?的早期爆發(fā)釋放以激活M1巨噬細(xì)胞清除病原體，以及Zn2?的持續(xù)釋放以誘導(dǎo)M2極化促進(jìn)成骨。該系統(tǒng)還具備抗氧化和抗菌性能，在大鼠感染性顱骨缺損模型中表現(xiàn)出顯著的骨再生能力。相關(guān)論文以“ Temporal Immunomodulatory Hydrogel Regulating the Immune-Osteogenic Cascade for Infected Bone Defects Regeneration ”為題，發(fā)表在Advanced Materials上，論文第一作者為Jin Chaonan。

示意圖1. TIH的設(shè)計(jì)與功能示意圖 TIH制備過程示意圖。該水凝膠通過時(shí)序釋放Ca2?/Zn2?離子調(diào)控免疫-成骨微環(huán)境，并具備抗菌、抗氧化和促血管生成性能，進(jìn)一步促進(jìn)感染性骨缺損中的成骨過程。

研究團(tuán)隊(duì)首先通過XPS、SEM、FTIR等手段驗(yàn)證了ZPH納米顆粒的成功合成與水凝膠的多孔結(jié)構(gòu)（圖1）。TIH在紫外光照射下3分鐘內(nèi)即可凝膠化，具有良好的可注射性與形狀適應(yīng)性。力學(xué)測試表明，0.5 wt% ZPH添加量下 hydrogel 抗壓強(qiáng)度最優(yōu)（273 kPa）。離子釋放實(shí)驗(yàn)顯示，Ca2?在24小時(shí)內(nèi)快速釋放（約60 mg/L），Zn2?則在7天內(nèi)緩慢釋放（第4天達(dá)2 mg/L），符合M1→M2極化時(shí)序需求。

圖1. TIH的制備與表征 a) TIH合成示意圖。b) ZIF-L、ZIF-L@PDA和ZPH納米顆粒的高分辨率XPS譜圖。c) ZIF-L、ZIF-L@PDA和ZPH納米顆粒的SEM圖像。d) TIH的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變過程，顯示其可注射性與快速凝膠能力。e) TIH的SEM及相應(yīng)元素分布圖，證實(shí)其多孔結(jié)構(gòu)及Ca、Zn元素的存在。f) TIH的儲(chǔ)能模量（G′）和損耗模量（G″）隨頻率變化。g,h) TIH在0.9% NaCl中隨時(shí)間釋放Ca2? (g) 和Zn2? (h) 的動(dòng)力學(xué)曲線。

在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，TIH展現(xiàn)出優(yōu)異的生物相容性，顯著促進(jìn)BMSCs增殖與遷移（圖2）。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示其遷移閉合率高達(dá)79%。血管生成實(shí)驗(yàn)表明，TIH能誘導(dǎo)HUVEC形成完整血管網(wǎng)絡(luò)，其促血管能力優(yōu)于對(duì)照組。此外，TIH憑借PDA和蛋白中的硫醇基團(tuán)有效清除ROS，恢復(fù)氧化應(yīng)激下的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，并通過對(duì)MRSA和E. coli的強(qiáng)烈抑制作用（12小時(shí)內(nèi)抑菌率超90%）表現(xiàn)出良好抗菌性能。

圖2. TIH的體外細(xì)胞相容性、遷移、血管生成與抗氧化能力 a) CCK-8檢測BMSCs與不同材料共培養(yǎng)后的細(xì)胞活性。b) BMSCs與TIH共培養(yǎng)后的三維形態(tài)。Vinculin免疫熒光染色顯示BMSCs在TIH內(nèi)黏附與生長良好。c) 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測不同處理下BMSCs的遷移活性。d) 通過測量傷口愈合面積定量分析BMSCs的遷移活性。e) 不同處理下HUVEC血管形成實(shí)驗(yàn)代表性圖像。f) 不同處理下血管網(wǎng)絡(luò)形成中網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與連接點(diǎn)的定量分析。g) DCFH-DA染色顯示不同處理下細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平。在H?O?誘導(dǎo)的氧化環(huán)境中，TIH處理后DCFH-DA熒光減弱，表明其抗氧化能力。h) H?O?組細(xì)胞熒光強(qiáng)度定量分析。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TIH能時(shí)序調(diào)控巨噬細(xì)胞內(nèi)Ca2?和Zn2?水平（圖3）。第1天Ca2?爆發(fā)促進(jìn)M1標(biāo)志物（CD86、iNOS）表達(dá)，第3天Zn2?積累驅(qū)動(dòng)M2標(biāo)志物（CD206）上調(diào)，實(shí)現(xiàn)M1→M2表型轉(zhuǎn)換。這一過程通過TRPC1-STAT1/NF-κB和STAT6/PPARγ信號(hào)通路分別介導(dǎo)，為免疫-成骨級(jí)聯(lián)調(diào)控提供離子基礎(chǔ)。

圖3. TIH對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣鋅振蕩與巨噬細(xì)胞極化的體外調(diào)控 a) FCM檢測干預(yù)1天和3天后巨噬細(xì)胞內(nèi)Ca2?和Zn2?熒光強(qiáng)度。b,c) FCM定量分析Ca2?陽性 (b) 和Zn2?陽性 (c) 細(xì)胞百分比。d) 免疫熒光圖像顯示與TIH共培養(yǎng)的RAW264.7巨噬細(xì)胞從第1天M1表型向第3天M2表型的時(shí)序轉(zhuǎn)變（藍(lán)色：DAPI，綠色：CD206，紅色：iNOS）。e) FCM檢測巨噬細(xì)胞表面CD86與CD206表達(dá)。f) FCM對(duì)巨噬細(xì)胞表面CD86與CD206表達(dá)的定量分析。

在成骨分化實(shí)驗(yàn)中，與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的BMSCs在TIH作用下表現(xiàn)出最高的ALP活性和礦化結(jié)節(jié)形成（圖4）。免疫熒光與RT-PCR結(jié)果顯示，成骨標(biāo)志物（BMP-2、RUNX2、OCN）和血管生成因子（VEGF）表達(dá)顯著上調(diào)，證實(shí)TIH通過免疫-成骨級(jí)聯(lián)調(diào)控促進(jìn)骨再生。

圖4. 免疫-成骨級(jí)聯(lián)調(diào)控對(duì)體外成骨分化的影響 a) 通過共培養(yǎng)TIH與RAW264.7巨噬細(xì)胞評(píng)估免疫-成骨級(jí)聯(lián)調(diào)控對(duì)成骨分化影響的實(shí)驗(yàn)示意圖。b,c) 不同處理下BMSCs的ALP染色 (b) 和ARS染色 (c)。d–g) 免疫熒光圖像顯示不同處理下BMSCs中成骨分化標(biāo)志物BMP-2 (d)、RUNX2 (e)、OCN (f) 和VEGF (g) 的表達(dá)。h) BMP-2、RUNX2、OCN和VEGF的細(xì)胞熒光強(qiáng)度定量。i) RT-PCR分析BMSCs中BMP-2、RUNX2、OCN和VEGF的基因表達(dá)水平。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了TIH的修復(fù)效果（圖5）。Micro-CT顯示TIH組缺損區(qū)骨再生明顯，骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨密度（BMD）和小梁數(shù)量（Tb.N）均顯著高于對(duì)照組。H&E和Masson染色顯示新生骨組織和膠原沉積增加，免疫組化與免疫熒光證實(shí)成骨與血管生成因子高表達(dá)，且巨噬細(xì)胞表型由M1向M2轉(zhuǎn)變（圖6）。重要器官未發(fā)現(xiàn)病理異常，表明TIH具有良好的生物安全性。

圖5. TIH促進(jìn)體內(nèi)感染性骨缺損再生 a) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。b) 術(shù)后8周顱骨Micro-CT三維重建圖像。c–e) 不同處理下骨痂體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨密度（BMD）和小梁數(shù)量（Tb.N）的定量分析。f,g) 術(shù)后8周顱骨H&E (f) 和Masson三色 (g) 染色圖像。缺損區(qū)域用箭頭標(biāo)出。下圖對(duì)應(yīng)框中區(qū)域的放大視圖。

圖6. TIH在感染性顱骨缺損中的體內(nèi)成骨、血管生成與免疫調(diào)節(jié)性能 a) 不同處理下術(shù)后顱骨中BMP-2、RUNX2、OCN和VEGF蛋白的免疫組化染色圖像及定量分析。b) 不同處理下術(shù)后顱骨中CD86和CD206表達(dá)的免疫熒光染色圖像及定量分析，揭示體內(nèi)巨噬細(xì)胞極化情況。

該研究成功開發(fā)出一種能夠時(shí)序調(diào)控免疫-成骨微環(huán)境的多功能水凝膠，通過Ca2?/Zn2?的序貫釋放協(xié)調(diào)巨噬細(xì)胞極化與成骨分化，整合抗菌、抗氧化、促血管和成骨等多重功能，為感染性骨缺損修復(fù)提供了一種創(chuàng)新策略。該時(shí)序免疫調(diào)節(jié)策略不僅適用于骨再生，還有望拓展至糖尿病創(chuàng)面、牙周缺損和腫瘤術(shù)后骨重建等復(fù)雜感染病理環(huán)境，具有廣泛的臨床轉(zhuǎn)化潛力。未來可進(jìn)一步探索可見光引發(fā)體系或無紫外交聯(lián)策略，以提升其臨床應(yīng)用安全性與適用性。

來源：高分子科學(xué)前沿

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