COVID-19 大流行凸顯了傳統(tǒng)“單病毒-單疫苗”策略在應(yīng)對(duì)高變異、跨物種傳播的 Beta 冠狀病毒屬（Sarbecovirus、Merbecovirus、Embecovirus、Nobecovirus 等）時(shí)的脆弱性。該屬成員不僅包括 SARS-CoV、MERS-CoV 及 SARS-CoV-2 等已造成重大公共衛(wèi)生事件的毒株，還涵蓋大量具有人畜共患潛力的蝙蝠與中間宿主病毒。中和抗體雖能快速提供保護(hù)，但其半衰期短，且對(duì)持續(xù)進(jìn)化的受體結(jié)合域（Receptor Binding Domain, RBD）突變高度敏感；相反，T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答主要靶向病毒內(nèi)部保守表位，展現(xiàn)出跨變異株、跨亞屬的交叉識(shí)別能力，且在抗體水平顯著下降后仍可維持長(zhǎng)期保護(hù)。然而，迄今尚缺乏系統(tǒng)研究闡明：（1）Beta 冠狀病毒屬基因組中真正高度保守的功能性片段范圍；（2）這些保守序列在人群中的 CD4+/CD8+ T 細(xì)胞免疫原性；（3）能否以最小化抗原片段覆蓋全球多族群的人類白細(xì)胞抗原（Human Leukocyte antigen, HLA）并誘導(dǎo)廣譜交叉免疫。

近期，cell雜志發(fā)表了題為“Highly conserved Betacoronavirus sequences are broadly recognized by human T cells”的文章。研究整合 Immune Epitope Database (IEDB) 中超2600 條經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的人 T 細(xì)胞表位與來(lái)自 Bacterial and Viral Bioinformatics Resource Center（BV-BRC）的 125 萬(wàn)余條病毒基因組數(shù)據(jù)，建立以免疫原性響應(yīng)頻率與跨亞屬序列保守度為雙閾值的 “保守 T 細(xì)胞表位區(qū)（CTER）” 篩選框架。通過(guò)對(duì) 29 名已接種疫苗并發(fā)生 SARS-CoV-2 突破性感染的多族裔志愿者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明 Spike-CTER 與 Rest-of-Proteome CTER（包括 N、nsp12、nsp13、ORF3a/7a 等 31 個(gè)片段，僅占病毒蛋白組 12%）可顯著增強(qiáng)對(duì) OC43、HKU1、MERS-CoV、Bat-SARS-like CoV 及 SARS-CoV 的交叉記憶 T 細(xì)胞反應(yīng)；將 CTER 與全長(zhǎng) Spike 聯(lián)合后，全球人群 HLA 覆蓋率提高約兩倍，且去除低覆蓋片段后仍可維持高覆蓋與免疫原性。該研究為開(kāi)發(fā)“極簡(jiǎn)-廣譜”泛 Beta 冠狀病毒 T 細(xì)胞疫苗提供了分子基礎(chǔ)與人群學(xué)依據(jù)。

主要內(nèi)容

1. IEDB 數(shù)據(jù)強(qiáng)化了 Spike 和 Nucleocapsid 作為CD4+和CD8+的關(guān)鍵靶標(biāo)

基于 IEDB 全文獻(xiàn)挖掘，本研究對(duì) SARS-CoV-2 全抗原組進(jìn)行系統(tǒng)級(jí)免疫原性量化。結(jié)果表明：（1）Spike 蛋白以 414 條 CD4+ 和 386 條 CD8+ 表位穩(wěn)居首位，核衣殼（N）次之（172/141 條），二者共同構(gòu)成結(jié)構(gòu)蛋白中免疫顯性核心（表1）；（2）非結(jié)構(gòu)蛋白 nsp3 在 CD8+ 貢獻(xiàn)突出（300 條），而其余結(jié)構(gòu)（M、E）、非結(jié)構(gòu)（nsp4、nsp12、nsp13）及輔助蛋白（ORF3a、7a、8）總計(jì)追加 224/524 條表位，提示 T 細(xì)胞可廣泛識(shí)別抗原譜系（表1）；（3）表位-HLA 限制分析覆蓋 68 個(gè) Class I 與 85 個(gè) Class II 等位基因，且研究來(lái)源在歐美、中國(guó)等多地域分布均衡，未見(jiàn)明顯人群偏向（圖1. A, B）。

綜上，IEDB 數(shù)據(jù)以人群水平再次確認(rèn) S 與 N 為 SARS-CoV-2 特異性 CD4+/CD8+ T 細(xì)胞應(yīng)答的免疫優(yōu)勢(shì)靶標(biāo)。

表1.IEDB收錄的SARS-CoV-2各蛋白T細(xì)胞表位實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

圖1.用于CTER設(shè)計(jì)的表位和病毒序列信息。（A）具有HLA class I 或 class II 限制的IEDB表位數(shù)目。（B）IEDB中SARS-CoV-2表位的地理分布。（C, D）蛋白質(zhì)序列從BV-BRC（https://www.bv-brc.org）下載，使用CD-HIT程序去除過(guò)度表示的序列，同時(shí)保持序列的多樣性，并從每個(gè)亞屬中選擇有代表性的序列作進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析。

2. 整合免疫原性和保守性打分定義 CTERs

為了系統(tǒng)評(píng)估 SARS-CoV-2 表位在 Beta 冠狀病毒屬內(nèi)的保守性，本研究首先針對(duì) GenBank 與 BV-BRC 中 1257887 條基因組存在的極端取樣偏倚（Sarbecovirus >1.2 M，Hibecovirus 僅 26 條）進(jìn)行了降維校正。采用 CD-HIT 聚類（每亞屬 20–30 代表株）→ MAFFT 高保真比對(duì) → BLAST 回貼自然序列的策略，最終為每個(gè)蛋白抽提 15–138 條病毒株，確保在亞屬水平保留最大遺傳多樣性（圖1. C,D）。隨后以中位序列一致性為指標(biāo)，為每條 IEDB 表位計(jì)算跨亞屬保守得分，并與 ImmunomeBrowser 導(dǎo)出的響應(yīng)頻率（RF）進(jìn)行整合：CD4+ 區(qū)段設(shè)定 RF>0.05 且保守度≥67%，CD8+ 區(qū)段設(shè)定 RF>0.05 且保守度≥80%。交疊上述免疫原-保守片段后，定義出可同時(shí)激活 CD4+ 與 CD8+ 記憶 T 細(xì)胞的廣譜保守 T 細(xì)胞表位區(qū)（CTERs），為后續(xù)疫苗抗原設(shè)計(jì)提供精簡(jiǎn)且跨亞屬覆蓋的分子框架。

3. S-CTERs 始終表現(xiàn)出更高的交叉反應(yīng)性T細(xì)胞反應(yīng)

在 29 名已接種且經(jīng) PCR 確認(rèn)的 SARS-CoV-2 突破性感染志愿者中，首先用 AIM 試驗(yàn)比較了 Spike-CTER（aa 811–840、901–940、961–1015、1206–1230）與 S-non-CTER 的免疫學(xué)特征（圖2. A,B）。雖然 S-non-CTER 在 CD4+（p = 0.0002）與 CD8+（p < 0.0001）層面呈現(xiàn)更高的瞬時(shí)反應(yīng)幅度，提示其包含更多免疫顯性表位，但交叉反應(yīng)性評(píng)估顯示，S-CTER 具有顯著優(yōu)勢(shì)：針對(duì) Embecovirus (OC43、HKU1)、Nobecovirus (HKU9)、Merbecovirus (MERS) 及 Sarbecovirus (SARS-CoV Tor2) 的代表株，S-CTER 誘導(dǎo)的 CD4+ 反應(yīng)在 HKU9、MERS、SARS-CoV Tor2 上 fold-change 顯著高于 S-non-CTER（p = 0.0191、0.0211、0.0325），CD8+ 反應(yīng)在 SARS-CoV Tor2 上亦顯著升高（p = 0.0024）。綜合交叉反應(yīng)頻率（fold-change > 0.33）分析進(jìn)一步證實(shí)，S-CTER 在 CD4+ 與 CD8+ 記憶池中均顯著擴(kuò)大了對(duì)多亞屬 Beta 冠狀病毒的識(shí)別廣度（p = 0.0312）（圖2. C-F）。因此，Spike-CTER 雖非免疫顯性最高區(qū)域，卻是驅(qū)動(dòng)跨病毒 T 細(xì)胞交叉記憶的關(guān)鍵保守片段，為泛 Beta 冠狀病毒疫苗的精簡(jiǎn)化設(shè)計(jì)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖2.CD4+ 和CD8+ T 細(xì)胞對(duì)刺突蛋白 CTER 和 non-CTER 區(qū)域的反應(yīng)。(A, B) 展示 S 蛋白中 CD4+ (A) 與 CD8+ (B) T 細(xì)胞的免疫原性和保守度模式：紅色曲線（右 y 軸）為響應(yīng)頻率 (RF)，灰色曲線（左 y 軸）為保守度評(píng)分。紅色虛線表示免疫顯性閾值 0.05；灰色點(diǎn)線分別對(duì)應(yīng) CD4+ 0.67 和 CD8+ 0.80 的保守度閾值。綠色框標(biāo)注保守 T 細(xì)胞表位區(qū) (CTER)。(C, D) CD4+ (C) 與 CD8+ (D) T 細(xì)胞應(yīng)答以倍數(shù)變化表示，即各 Beta 冠狀病毒代表株相對(duì)于祖先型 SARS-CoV-2 S 肽庫(kù)反應(yīng)強(qiáng)度的比值（n = 27）。顯著性采用 Mann–Whitney 檢驗(yàn)（p < 0.05）。(E, F) 展示 CD4+ (E) 與 CD8+ (F) 應(yīng)答中具有交叉反應(yīng)（倍數(shù)變化 > 0.33）的個(gè)體比例，涵蓋所測(cè)試的各 Beta 冠狀病毒物種。

4. 在 RP 中鑒定到其他的保守區(qū)域

將 Spike 之外的 SARS-CoV-2 蛋白組納入分析后，共鑒定 31 個(gè)保守 T 細(xì)胞表位區(qū)（CTER），覆蓋 1,326/6,484 aa（20%）；其中 N 蛋白以 340/419 aa（81%）的兩大 CTER 占據(jù)主導(dǎo)地位，nsp12 與 nsp13 分別貢獻(xiàn) 300/932 aa（36%）和 173/601 aa（32%），ORF3a 與 ORF7a 亦分別捕獲 58% 與 71% 序列，而 E 蛋白含 47%，M 蛋白無(wú) CTER；整體僅占完整病毒蛋白組 13% 的片段即可定義全部 CTER，為構(gòu)建極簡(jiǎn)、跨 Beta 冠狀病毒屬的 T 細(xì)胞疫苗提供了精確抗原譜（圖3. A-J）。

圖3.（A-J）CD4+ 和 CD8+ T細(xì)胞反應(yīng)映射到SARS-CoV-2蛋白：N (A)；E (B); M (C); nsp3-4 和 12-13 (D-G)；ORF3a、7a、8a （H-J）。

5. 在單個(gè)表位水平上，不同冠狀病毒亞屬的交叉反應(yīng)性不同

為了在單個(gè)表位水平驗(yàn)證交叉反應(yīng)，作者利用已證實(shí)對(duì) SARS-CoV-2 表位 ORF7a90、N134、N311 與 N387 有應(yīng)答的供者 PBMC 建立短期 T 細(xì)胞系（TCL），并對(duì)在之前保守性分析序列集中出現(xiàn)頻率 ≥2% 的同源肽進(jìn)行 FluoroSpot IFN-γ 檢測(cè)（1–0.001 μg/mL 劑量梯度）。結(jié)果如圖4所示：ORF7a90 的 6 條 Sarbecovirus 同源肽、N134 的 2 條 Embecovirus 同源肽、N311 的 2 條 Merbecovirus+2 條 Sarbecovirus 同源肽，以及 N387 的 1 條 Sarbecovirus+3 條 Merbecovirus 同源肽均可誘導(dǎo)顯著交叉反應(yīng)。該結(jié)果提示，單一保守表位的跨亞屬覆蓋度存在明顯差異；而靶向包含多表位的更廣區(qū)域有望克服這種可變性，從而提升 T 細(xì)胞對(duì) Beta 冠狀病毒屬的廣譜交叉潛能。

圖4.N-CTER和non-S/N-CTER MPs的交叉反應(yīng)性反應(yīng)。(A) IFNγ (SFC/106) FluoroSpot對(duì)SARS-CoV-2和同源冠狀病毒肽的劑量反應(yīng)（按亞屬顏色編碼）。(B)序列同一性、殘留變化、總劑量反應(yīng)性和相對(duì)活性匯總表。

6. RP-CTERs增強(qiáng)T細(xì)胞跨冠狀病毒的交叉反應(yīng)性

為系統(tǒng)評(píng)估 Rest-of-Proteome CTER（RP-CTER）相較于現(xiàn)行全長(zhǎng) Spike（Full S）疫苗的交叉潛力，作者在同一隊(duì)列 PBMC 中平行檢測(cè)兩類肽庫(kù)誘導(dǎo)的記憶 T 細(xì)胞反應(yīng)。盡管 RP-CTER 在 CD4+ 與 CD8+ 的瞬時(shí)免疫幅度均顯著低于 Full S，其在多亞屬 Beta 冠狀病毒中的交叉反應(yīng)性卻顯著優(yōu)于后者：CD4+ 對(duì) OC43、HKU9、MERS、Bat-SARS 及 SARS-CoV Tor2 的 fold-change 均顯著升高（p ≤ 0.0075），CD8+ 在 HKU1、OC43、MERS、Bat-SARS 與 SARS-CoV Tor2 亦呈一致優(yōu)勢(shì)（p ≤ 0.0419，圖 5A–B）；綜合交叉反應(yīng)頻率（fold-change > 0.33）在 CD4+ 與 CD8+ 記憶池中均顯著優(yōu)于 Full S（p = 0.0312，圖 5C–D）。N 蛋白與非 S/N-CTER 片段分別貢獻(xiàn)不同的交叉模式。Spearman 分析進(jìn)一步揭示保守度與免疫原性呈正相關(guān)，提示高保守區(qū)更可能誘導(dǎo)強(qiáng)勁 T 細(xì)胞應(yīng)答。綜上，RP-CTER 可通過(guò)擴(kuò)展保守表位識(shí)別譜系，顯著提升跨 Beta 冠狀病毒屬的 T 細(xì)胞交叉記憶，為下一代極簡(jiǎn)廣譜疫苗設(shè)計(jì)提供了關(guān)鍵抗原框架。

圖5.RP CTERs與Full Spike (S)的交叉反應(yīng)性比較。（A和B）與祖先的Full S （S-CTER + S-non-CTER）和RP-CTER MPs （n = 27）相比，CD4+ (A) 和 CD8+ (B)反應(yīng)在乙型冠狀病毒中顯示出倍增變化。經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p < 0.05）。（C和D） CD4+ (C) 和 CD8+ (D)反應(yīng)中出現(xiàn)交叉反應(yīng)的個(gè)體的頻率。

7. 將RP-CTERs與完整的S蛋白結(jié)合可以提高種群覆蓋率

通過(guò) NetMHCpan 系列算法對(duì) 15 個(gè)地理-族群人群進(jìn)行 HLA 覆蓋預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示：將全長(zhǎng) Spike（Full S）與 RP-CTER 聯(lián)合后，CD4+ 與 CD8+ 的潛在 epitope-HLA 組合數(shù)均提升 >2 倍（class II 與 class I 均 p < 0.0001），且該優(yōu)勢(shì)在全球及各區(qū)域累積頻率曲線中保持一致（圖 6A–D）。在 27 名已 HLA 分型的接種-感染雙重暴露志愿者中，聯(lián)合抗原同樣使實(shí)際可呈遞組合數(shù)增加約 2 倍，剔除低覆蓋的 Env、nsp12、nsp13 等 CTER 后（RP-CTER-HC），抗原長(zhǎng)度壓縮至原 CTER 的 18%（全蛋白組 12%），而人群覆蓋率與免疫原性未受顯著影響（class II p = 0.3761；CD4+ 反應(yīng) p = 0.2029；CD8+ 反應(yīng) p = 0.3125，圖6 E, F）。因此，“Full S + 高覆蓋 RP-CTER”策略在保持廣譜交叉反應(yīng)的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了最小化抗原集與最大化人群覆蓋的雙重優(yōu)化，為下一代泛 Beta-CoV 疫苗提供了高效、可擴(kuò)展的設(shè)計(jì)框架。

圖6. HLA class II 和 class I 對(duì)人類HLA人群覆蓋率的影響。（A和B）class II (A)和 class I (B)表位- HLA組合人群覆蓋率熱圖；規(guī)模，每個(gè)組合的平均點(diǎn)擊數(shù)。右圖比較了世界上每個(gè)地區(qū)蛋白質(zhì)組合的平均點(diǎn)擊率。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)不同的區(qū)域。Mann-Whitney檢驗(yàn)（p < 0.05）。（C和D） II類(C)和I類(D)中識(shí)別的表位- hla組合的累積頻率曲線，顯示了在世界人口中所覆蓋的組合比例。（E和F）Full S + RP-CTER與其高覆蓋版本Full S + RP-CTER HC（高覆蓋）聯(lián)合治療CD4+ (E)和CD8+ (F) T細(xì)胞應(yīng)答的比較（n = 27）。

本研究系統(tǒng)整合了 IEDB 的2600余條人T細(xì)胞表位與120萬(wàn)條Beta冠狀病毒基因組，首次定義僅覆蓋SARS-CoV-2全長(zhǎng)蛋白13%的31個(gè)保守T細(xì)胞表位區(qū)（CTER）。體外AIM與FluoroSpot實(shí)驗(yàn)顯示，S-CTER與RP-CTER（含N、nsp12、nsp13、ORF3a/7a等）可在已接種且感染的志愿者PBMC中誘導(dǎo)針對(duì)OC43、HKU1、MERS、Bat-SARS及SARS-CoV Tor2的交叉記憶T細(xì)胞反應(yīng)；RP-CTER與全長(zhǎng)Spike聯(lián)合使CD4+/CD8+交叉反應(yīng)及全球HLA人群覆蓋均提升約兩倍。進(jìn)一步剔除低覆蓋片段后，抗原長(zhǎng)度壓縮至全蛋白組的12%，覆蓋與免疫原性無(wú)顯著下降。Spearman分析證實(shí)保守度與免疫原性正相關(guān)，提示病毒功能必需區(qū)更易被T細(xì)胞識(shí)別。該策略為泛Beta冠狀病毒疫苗提供了可直接落地的極簡(jiǎn)抗原譜，并可擴(kuò)展至其他高變異病毒家族。

來(lái)源 病毒生物信息學(xué)

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