近日，《Plant Biotechnology Journal》雜志在線發(fā)表了由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)陳慶山教授團(tuán)隊(duì)撰寫的論文“Design of High-Diacylglycerol and Lecithin Soybean Seed Oil Using GmPDATs and GmDGATs Knockout via a CRISPR-Cas9 System”。該研究通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除大豆中GmDGAT1A/B/C與GmPDAT1B/D/2A/2B基因，實(shí)現(xiàn)種子脂質(zhì)合成途徑重定向，成功創(chuàng)制出富含二酰甘油（DAG）和卵磷脂的大豆新種質(zhì)。該成果為功能性食用油開發(fā)、大豆?fàn)I養(yǎng)品質(zhì)改良提供了有效策略與種質(zhì)基礎(chǔ)。

三酰甘油（TAG）是大豆油脂的主要成分，其經(jīng)消化代謝后易轉(zhuǎn)化為儲(chǔ)能脂肪，增加機(jī)體代謝負(fù)擔(dān)。DAG是天然的TAG替代脂質(zhì)，具有促進(jìn)脂肪氧化、抑制體質(zhì)量增加、降低內(nèi)臟脂肪含量、改善血清膽固醇水平、調(diào)節(jié)血糖等多種生理功能。此外，大豆油脂中還含有卵磷脂等多種生物活性物質(zhì)。在卵磷脂的組成成分中，磷脂酰膽堿（PC）占比最高，其次為磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰肌醇（PI）。卵磷脂兼具優(yōu)良乳化特性與潛在健康益處，廣泛應(yīng)用于食品與醫(yī)藥領(lǐng)域。傳統(tǒng)大豆油中DAG與卵磷脂含量較低，難以滿足消費(fèi)者對(duì)“營(yíng)養(yǎng)+功能”的雙重需求。

植物中TAG主要經(jīng)Kennedy通路由DGAT（二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶）催化生成，亦可由PDAT（磷脂:二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶）以PC為酰基供體合成，這兩種酶共同調(diào)控DAG—PC—TAG的碳流平衡。本研究采用CRISPR-Cas9技術(shù)在大豆中精準(zhǔn)敲除GmDGATs家族與GmPDATs家族關(guān)鍵成員，阻斷TAG合成的兩條主要通路，協(xié)同提升“高二酰甘油（高DAG）”與“高卵磷脂”兩項(xiàng)優(yōu)質(zhì)性狀，創(chuàng)制可直接應(yīng)用的大豆新種質(zhì)，并提出高效的油脂品質(zhì)改良基因編輯策略。

本研究通過(guò)同源比對(duì)獲得8個(gè)GmPDAT家族基因和3個(gè)GmDGAT1家族基因，結(jié)合基因表達(dá)、蛋白定位及功能互補(bǔ)驗(yàn)證等，選取GmPDAT1B/1D/2A/2B與GmDGAT1A/B/C作為候選基因。進(jìn)一步構(gòu)建含3個(gè)sgRNA的基因編輯載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化體系，共獲得34株T0陽(yáng)性植株，其中11株在靶位發(fā)生突變，突變類型均為插入/缺失（indel）導(dǎo)致的移碼突變。從突變株系（T1）中篩選出8個(gè)具有不同基因組合的純合突變體，用于后續(xù)成分與功能驗(yàn)證。

GmDGATs-GmPDATs雙基因敲除突變體的表型綜合分析

脂質(zhì)組學(xué)分析顯示，所有突變體種子中DAG與PC含量均顯著升高：其中突變體c23-1的DAG與PC含量分別為野生型的10.0倍和7.56倍，突變體c23-3的DAG與PC含量分別為野生型的8.7倍和7.32倍。同時(shí)，突變體中磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰絲氨酸（PS）、磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰乙醇胺（PE）含量也顯著增加。此外，突變體種子外觀及植株生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)與野生型無(wú)顯著差異，保障了新種質(zhì)的育種實(shí)用性。本研究成功創(chuàng)制“高DAG-高卵磷脂”大豆新種質(zhì)，同時(shí)驗(yàn)證了面向油脂品質(zhì)定向改良的高效多基因編輯策略。

機(jī)制層面，GmDGAT1A/B/C基因敲除阻斷了Kennedy途徑中依賴酰基-CoA的TAG合成關(guān)鍵反應(yīng)步驟，導(dǎo)致TAG合成前體物質(zhì)DAG大量積累；而GmPDAT1B/D/2A/B基因敲除則抑制了以PC為?；w的TAG替代合成途徑，促使PC及其他磷脂類物質(zhì)積累。值得注意的是，同時(shí)敲除上述DGAT與PDAT家族基因可產(chǎn)生顯著協(xié)同效應(yīng)，尤其DGAT1A、DGAT1B與PDAT1B的聯(lián)合敲除株系，其DAG與PC含量達(dá)到最高水平。這種雙通路阻斷策略可有效將代謝流從TAG合成途徑導(dǎo)向DAG與PC的積累過(guò)程。

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)陳慶山教授、楊明亮副教授、胡振幫高級(jí)實(shí)驗(yàn)師為本論文的通訊作者，趙瑩副教授為本論文的第一作者，博士研究生張濱爍、田慧琳、劉洋、崔一凡、王思慧參與了研究工作。本研究得到了科技創(chuàng)新2030-農(nóng)業(yè)生物育種重大項(xiàng)目（2023ZD0403101）、國(guó)家自然科學(xué)基金（32501888、U23A201783、32272093）的資助。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1111/pbi.70383