編輯丨王多魚

排版丨水成文

題圖為盧培龍研究員

離子通道在神經傳導、肌肉收縮和細胞信號轉導等關鍵生物學過程中發(fā)揮重要作用，其開閉狀態(tài)受電壓、配體或機械力等特定刺激的精確調控。從頭設計能夠響應外界刺激并發(fā)生構象變化的跨膜蛋白，是蛋白質工程領域的重要目標，也是技術難點。

由于蛋白質動態(tài)結構設計的復雜性，實現具有自定義門控功能的跨膜離子通道從頭設計，目前仍是一項尚未突破的挑戰(zhàn)。成功設計出可響應特定刺激的動態(tài)跨膜蛋白，不僅有助于深入理解膜蛋白的工作機制和膜生物學的基本原理，還將拓展其在生物醫(yī)學與生物技術中的廣泛應用前景，帶來全新的發(fā)展機遇。

2025 年 10 月 16 日，西湖大學生命科學學院、西湖實驗室及遺傳物質表達與重構全國重點實驗室盧培龍團隊，聯合西湖實驗室/西湖大學李波、黃晶等團隊，在國際頂尖學術期刊Cell 上發(fā)表題為：De novodesigned voltage-gated anion channels suppress neuron firing的研究論文。

經過六年系統(tǒng)攻關，研究團隊在國際上首次實現了電壓門控陰離子通道（de novodesignedvoltage-gatedanionchannels，dVGAC）的精確從頭設計。該人工通道的離子選擇機制與電壓響應機制均不同于天然離子通道。研究通過生化分析、冷凍電鏡結構解析、膜片鉗電生理記錄及分子動力學模擬，全面驗證了其結構與功能，并在小鼠模型中證實其可有效抑制神經元電活動。

該成果不僅表明科學家已具備從頭設計具有“動態(tài)開關”功能的跨膜蛋白的能力，更證明此類人工蛋白可在活體動物中發(fā)揮生理作用，標志著 AI 驅動的生物分子設計向實際應用邁出了關鍵一步。

盧培龍，2009 年本科畢業(yè)于中國科學技術大學生命學院；2014 年博士畢業(yè)于清華大學生命學院，師從施一公教授；之后在華盛頓大學進行博士后研究，師從蛋白質設計先驅David Baker教授；2019 年加入西湖大學生命科學學院，組建蛋白質設計/合成生物學實驗室。

從頭設計電壓門控離子通道面臨四大挑戰(zhàn)：其一，跨膜區(qū)域引入帶電氨基酸是實現電壓響應的關鍵，但此類殘基在疏水環(huán)境中能量不利，易影響蛋白穩(wěn)定性；其二，需精確模擬不同膜電位下門控氨基酸的構象變化；其三，人工通道的離子選擇性與電壓敏感性應具備可調控性；其四，必須確保蛋白質核心的氨基酸相互作用足以穩(wěn)定跨膜孔道結構，并維持其在脂質膜中的功能性構象。

從頭設計含15次跨膜螺旋的五聚體蛋白

研究團隊采用參數化方程與片段組裝相結合的方法，從頭設計了一個由 15 根 α 螺旋組成的五聚體跨膜蛋白骨架 TMH3C5，形成兩層同心環(huán)結構，每個亞基包含 3 根 α 螺旋。為拓展結構多樣性，研究團隊進一步通過采樣 α 螺旋沿 Y 軸的傾斜角 θ，構建出具有漏斗狀孔道的內環(huán)螺旋束。該結構的超螺旋半徑沿中心軸動態(tài)變化，更有利于通過孔道內部門控氨基酸的構象調整實現孔徑調控。

從頭設計含15根α螺旋的五聚體跨膜蛋白

隨后，團隊利用ProteinMPNN設計可溶性蛋白的氨基酸序列，并通過 AlphaFold2 預測其三維結構，篩選出與目標模型高度匹配的候選序列。在此基礎上，通過重設計候選蛋白的表面殘基，將其親水表面轉化為疏水表面，最終獲得 8 個結構與預測模型高度一致的跨膜蛋白設計體。這些蛋白的基因被合成并在大腸桿菌中成功表達，其中跨膜蛋白tmZC8表現出良好的性質。為解析其三維結構，研究團隊將 tmZC8 與 KCTD1 蛋白的同源五聚體 BTB 結構域在 N 端融合，構建融合蛋白tmZC8-BTB。冷凍電鏡解析結果顯示，tmZC8-BTB 的整體結構與設計模型高度吻合，跨膜區(qū) Cα 原子的 RMSD 僅為 1.33 ?，驗證了設計的準確性。

tmZC8-BTB冷凍電鏡結構與設計模型的比較

從頭設計電壓門控陰離子通道dVGAC

研究團隊在從頭設計的跨膜五聚體蛋白 tmZC8-BTB 的孔道內引入帶電氨基酸（例如精氨酸，Arginine），作為門控殘基，以賦予其電壓敏感性和離子選擇性?？椎乐械木彼釟埢纬梢粋€狹窄區(qū)域，兼具電壓感應和離子選擇功能：既作為電壓傳感器（voltage sensor），又充當離子選擇過濾器（selectivity filter）。膜片鉗實驗表明，其中一個設計變體tmZC8-3R-BTB（含R157、R161和R165三個精氨酸突變）表現出顯著的電壓依賴性電流。

當膜電位超過 40 mV 時，電流迅速上升，表明通道開放。該通道高度選擇性地通透氯離子（Cl?），幾乎不傳導鈉離子等陽離子，陰離子通透順序為 Cl? > Br? > F? > NO?? > I?。單通道記錄顯示，tmZC8-3R-BTB 的單通道電流與電壓呈線性關系，表明其單通道電導恒定；但通道開放概率隨電壓升高而增加，說明電壓通過調節(jié)開放概率實現門控。

上述結果證實tmZC8-3R-BTB是一種從頭設計的電壓門控陰離子通道，因此被重新命名為dVGAC（de novo designed Voltage-Gated Anion Channel）。隨后，研究團隊解析了 dVGAC 的冷凍電鏡結構，分辨率達 2.9 ?。結構分析顯示，其實際構象與設計模型高度一致，跨膜區(qū) Cα 原子的 RMSD 僅為 1.09 ?，驗證了該通道的精確從頭設計。電鏡結構中，精氨酸 R157 的側鏈構成孔道最窄處，最小半徑為 0.5 ?，小于氯離子的半徑（約1.8 ?），表明該結構對應于通道的關閉狀態(tài)。

為進一步探究門控機制，研究團隊開展了不同電壓條件下的分子動力學模擬。結果顯示，dVGAC 的主鏈結構在電壓變化下保持穩(wěn)定，而精氨酸約束區(qū)的側鏈則呈現構象變化。模擬還再現了實驗觀察到的氯離子選擇性通透、陽離子阻斷以及電流隨電壓升高的現象，與設計原理高度一致。

dVGAC1.0抑制小鼠大腦神經元活動

由于離子通透性對孔道的化學環(huán)境和幾何結構高度敏感，研究團隊通過改變孔道內的氨基酸殘基，成功調控了 dVGAC 的離子選擇性與電壓敏感性。他們在孔道不同位點引入帶電氨基酸突變，發(fā)現 dVGAC 的 L153R 突變體表現出與 dVGAC 不同的陰離子選擇順序：Cl? > Br? > I? > NO?? > F?。尤為值得注意的是，dVGAC 的 R165D 突變體（命名為dVGAC1.0）在僅 20 mV 的膜電位下即可激活，并介導顯著電流，且離子選擇性順序與 dVGAC 保持一致。

由于許多神經元在產生動作電位時膜電位可超過 20 mV，這提示 dVGAC1.0 有望用于調控神經元活動。為此，研究團隊將表達人工設計離子通道 tmZC8-BTB、dVGAC 或 dVGAC1.0 的腺相關病毒（AAV）注射至 Prkcd-Cre 小鼠的杏仁核中央核（CeA）。結果顯示，這些設計通道均能在 CeA 神經元中高效表達。更重要的是，表達 dVGAC1.0 的神經元放電頻率顯著降低，而表達 dVGAC 的神經元放電特性與鄰近未感染細胞無異。該結果證實，從頭設計的電壓門控陰離子通道在生理條件下具備調控神經元活動的能力，為開發(fā)用于調控細胞及神經功能的人工通道蛋白藥物提供了新思路。

該研究在從頭設計功能性跨膜蛋白方面取得重要突破，實現了從以往僅能構建“靜態(tài)”膜蛋白結構，到如今可設計具有“動態(tài)”響應能力、能對外界刺激產生構象變化的跨膜蛋白的跨越。這類新型蛋白可像“分子開關”一樣，根據環(huán)境變化切換構象，在細胞中執(zhí)行特定功能。研究團隊成功從頭設計出可由基因編碼的電壓門控陰離子通道 dVGAC，并在哺乳動物細胞和神經元中驗證了其功能，展現出調控細胞及神經活動的巨大潛力。值得注意的是，dVGAC 的電壓激活閾值可按需調節(jié)，從而實現對神經元活動的精確控制。該成果為構建響應特定分子或物理信號的新型跨膜蛋白提供了可行路徑，具有廣泛的應用前景。

從頭設計可控制神經元活動的電壓門控陰離子通道dVGAC

西湖大學博士生周晨、博士生李輝燦和博士生王佳興為該論文的共同第一作者。西湖大學盧培龍研究員為最后通訊作者，吳坤博士、黃晶研究員、講席教授李波為共同通訊作者。西湖大學博士生錢程、熊暉博士、初智霖博士、邵齊明博士、李軒博士、碩士生孫詩津、孫科博士、清華大學靳雪芹博士以及浙江大學楊帆教授等為該研究做出了貢獻。

2025 年 2 月 19 日，西湖大學盧培龍團隊在國際頂尖學術期刊Nature發(fā)表了題為：De novo design of transmembrane fluorescence-activating proteins 的研究論文。

該研究通過結合深度學習和基于能量的方法，成功設計出了能夠特異性結合熒光配體的跨膜熒光激活蛋白（tmFAP），首次實現了跨膜蛋白與配體分子在膜內的非共價相互作用的精確從頭設計，并展示了其在活細胞中的熒光激活能力。

2024 年 10 月 2 日，西湖大學盧培龍團隊、陶亮團隊（呂莘辰、張媛媛為共同第一作者）合作，在Nature Communications期刊發(fā)表了題為：De novo?design of mini-protein binders broadly neutralizing?Clostridioides difficile?toxin B variants 的研究論文。

該研究從頭設計了一種廣譜迷你中和蛋白，能夠以高親和力結合多種艱難梭菌毒素B（TcdB）亞型，并在細胞及動物模型中表現出高效且廣譜的保護作用。

2024年 8 月 14 日，西湖大學盧培龍團隊與清華大學劉磊團隊合作（孫科、李思聰、鄭博聞、朱雁磊、王通越為共同第一作者），在Cell Research期刊發(fā)表了題為：Accurate de novo design of heterochiral protein–protein interactions 的研究論文。

該研究從頭設計了靶向L型蛋白質或L型多肽的特定表面區(qū)域的D型蛋白質，這也是首次實現異手性蛋白復合物的精確從頭設計。該研究在全面了解異手性蛋白-蛋白相互作用的結構原理方面取得了重大進展，有望最終提高蛋白質設計的成功率。

2020 年 8 月 26 日，西湖大學盧培龍團隊與華盛頓大學David Baker團隊合作，在Nature期刊發(fā)表了題為：Computational Design of Transmembrane Pores 的研究論文。

該研究在世界上首次實現了跨膜孔蛋白的精確從頭設計。

2018 年 3 月 2 日，盧培龍作為第一作者，在Science期刊發(fā)表了題為：Accurate computational design of multipass transmembrane proteins 的研究論文。

該研究在世界上首次實現了多達 8 個跨膜區(qū)域的跨膜蛋白的精確從頭設計，為設計具有新功能的多跨膜蛋白奠定了基礎。

論文鏈接：

1. https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(25)01091-8

2. https://www.nature.com/articles/s41586-025-08598-8

3. https://www.nature.com/articles/s41467-024-52582-1

4. https://www.nature.com/articles/s41422-024-01014-2

5. https://www.nature.com/articles/s41586-020-2646-5

6. https://www.science.org/doi/10.1126/science.aaq1739