為什么要關(guān)心 RNA 修飾？

RNA 不僅僅是基因信息傳遞的中間產(chǎn)物，其本身還攜帶多種化學(xué)修飾，這些修飾為基因表達調(diào)控提供了一層動態(tài)而精細的調(diào)控機制。目前已發(fā)現(xiàn)超過 170 種 RNA化學(xué)修飾，廣泛分布于mRNA和各類非編碼RNA中，包括m6A、m5C、Ψ、ac4C、Nm、m1A、m7G、A-to-I 等。它們通過影響 RNA 的穩(wěn)定性、剪接、翻譯和定位等過程，參與發(fā)育調(diào)控、維持生理穩(wěn)態(tài)，并與多種疾病密切相關(guān)。傳統(tǒng)的 RNA 修飾檢測方法（如 LC-MS/MS、ELISA、SELECT、MeRIP-seq、miCLIP、RNA-BisSeq 等）雖在揭示 RNA 修飾方面取得了重要成果，但也存在顯著局限：依賴抗體或化學(xué)標記的方法易產(chǎn)生特異性不足或交叉反應(yīng)；實驗流程復(fù)雜，可能引入系統(tǒng)性偏好；逆轉(zhuǎn)錄等步驟會破壞 RNA 的原生修飾信息；對低豐度轉(zhuǎn)錄本或同一分子上多重修飾的識別能力有限。當前，盡管短讀長 RNA 測序技術(shù)推動了全轉(zhuǎn)錄組范圍的 RNA 修飾研究，但由于讀長和逆轉(zhuǎn)錄步驟的限制，準確性仍需提高，且難以實現(xiàn)多種修飾的同時識別。這些挑戰(zhàn)使得開發(fā)更高精度、無偏、可同時檢測多修飾的新方法成為 RNA 修飾研究的重要方向。

圖1、真核 mRNA 中的多樣化化學(xué)修飾

Nanopore 直接 RNA測序：檢測RNA修飾的新利器

Oxford Nanopore Technologies（ONT）開發(fā)的直接 RNA 測序（Direct RNA Sequencing, DRS）技術(shù)是一種具有革命性意義的長讀長測序方法。它摒棄了傳統(tǒng) RNA 測序中的 PCR 和逆轉(zhuǎn)錄步驟，能夠直接讀取天然 RNA 分子的序列，從而完整保留其化學(xué)修飾信號。在該平臺中，RNA 分子在電壓驅(qū)動下穿過納米孔道，不同堿基及其化學(xué)修飾會引起特征性的電流擾動，通過結(jié)合機器學(xué)習(xí)等算法對電流信號進行分析，即可在單分子、單堿基水平上識別 RNA 修飾。該技術(shù)具有顯著優(yōu)勢：一是能夠在原生狀態(tài)下讀取 RNA，避免修飾信息丟失；二是具備單分子、單堿基分辨率，理論上可檢測每個 RNA 分子的修飾；三是能同時識別多種修飾類型，不僅限于m6A，還可檢測 m5C、Ψ、ac4C、Nm、m1A、m7G、A-to-I等修飾。當前，基于ONT的m6A修飾檢測方法已相對成熟，而針對其他修飾（如 Nm、ac4C、m7G、Ψ 等）的識別算法仍在快速發(fā)展之中。在本綜述中，我們不僅總結(jié)了利用 DRS 數(shù)據(jù)識別m6A修飾的最新進展與應(yīng)用，更將重點關(guān)注那些相對被忽視的修飾類型（如Ψ、ac4C、Nm、m1A、m7G、A-to-I編輯），綜述其在 Nanopore DRS 平臺下的研究現(xiàn)狀、算法發(fā)展與未來面臨的挑戰(zhàn)。

圖二、ONT DRS 測序工作流程及 RNA 修飾檢測示意圖

Nanopore 直接 RNA測序：檢測RNA修飾的新利器

m6A是目前研究最為深入、分布最廣泛的 RNA 化學(xué)修飾，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、RNA 命運決定及疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用。基于DRS數(shù)據(jù)的m6A檢測，也成為 RNA 修飾研究方法發(fā)展的“風(fēng)向標”。

早期研究多基于信號統(tǒng)計或錯誤率差異的策略，如 Tombo、DiffErr、DRUMMER 等工具通過分析電流信號偏離或 basecalling 錯誤率（如 mismatch、插入、缺失）的變化，對比對照與敲除樣本以定位潛在修飾位點，思路直觀且實現(xiàn)簡便。隨后，經(jīng)典機器學(xué)習(xí)方法被引入該領(lǐng)域，如 EpiNano、MINES、Nanom6A、Yanocomp 等工具綜合信號特征、錯誤率與序列特征（如 DRACH motif），利用監(jiān)督學(xué)習(xí)模型（如隨機森林、XGBoost）進行修飾預(yù)測，并常借助 CLIP-seq 或 MeRIP-seq 數(shù)據(jù)提升精度。

這類方法成熟高效，但對訓(xùn)練集依賴較強，對低豐度或非經(jīng)典序列位點的識別能力仍有限。近年來，深度學(xué)習(xí)策略的興起推動了m6A檢測的進一步發(fā)展，研究者利用 Bi-LSTM、WaveNet、殘差網(wǎng)絡(luò)及卷積–遞歸混合架構(gòu)等深層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)從原始電流信號中自動提取特征，實現(xiàn)高精度預(yù)測。

其中，m6Anet 采用多實例學(xué)習(xí)（MIL）框架，在無顯式標簽條件下通過單分子特征識別修飾位點與豐度；DENA、m6ATM、RedNano、Xron 等模型通過復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和特征融合提升模型的跨物種與跨實驗條件泛化能力；而 Pum6a、m6Aiso、SingleMod 等方法則致力于單分子層面的m6A定量與異構(gòu)體檢測。此外，m6ABasecaller、DEMINERS 等 pipeline 嘗試將修飾檢測直接嵌入 basecalling 流程，實現(xiàn)高通量與實時分析。

隨著 DRS 技術(shù)的成熟，其應(yīng)用已從m6A擴展至 Ψ、Nm、m1A、5moU 以及A-to-I編輯等多種修飾，但由于這些修飾對電流信號擾動更為細微且訓(xùn)練數(shù)據(jù)稀缺，其識別仍具挑戰(zhàn)。代表性工作包括 ModQuant 模型利用合成修飾 RNA 序列進行 Ψ 的監(jiān)督學(xué)習(xí)預(yù)測，NanoPsu、Penguin、IndoC、Mod-p ID、NanoPsiPy 等方法基于信號差異實現(xiàn)無需對照樣本的 Ψ 檢測；m1A-prediction 模型通過分析電流信號特征并結(jié)合 XGBoost 實現(xiàn)單分子層面的m1A檢測；Dinopore 結(jié)合電流信號、basecalling 誤差及質(zhì)量分數(shù)訓(xùn)練 CNN 模型，實現(xiàn)對A-to-I編輯的高準確度識別，并具有良好的跨物種泛化能力；而 Nm-Nano 與 NanoML-5moU 則利用機器學(xué)習(xí)分類器結(jié)合信號特征與 k-mer 嵌入實現(xiàn) Nm 與 5moU 修飾的高精度定量分析。

值得注意的是，在真實 RNA 分子中，多種修飾往往共存或相互作用（cross-talk），因而研究者逐漸從單一修飾檢測轉(zhuǎn)向多修飾協(xié)同分析。為應(yīng)對這一復(fù)雜性，新的計算框架相繼被提出，如利用遷移學(xué)習(xí)與多標簽深度學(xué)習(xí)模型同時預(yù)測多種修飾（如 TandemMod 模型），或通過對比修飾樣本與對照樣本信號分布差異識別潛在修飾（如 Nanocompore、xPore）。

此外，無監(jiān)督與異常檢測模型（如 nanoDoc）通過學(xué)習(xí)未修飾信號分布來發(fā)現(xiàn)未知修飾，而 ONT Dorado + Remora 框架則將修飾識別直接嵌入 basecalling 流程，實現(xiàn)多修飾的實時聯(lián)合檢測。部分模型（如 modCnet）更針對特定修飾組合（如ac4C與m5C）進行聯(lián)合建模，以捕捉修飾間的共存模式。這些進展表明，基于 Nanopore DRS 的 RNA

總結(jié)與展望：

盡管 Nanopore 直接 RNA 測序（DRS）技術(shù)在 RNA 修飾檢測領(lǐng)域取得了顯著進展，但仍面臨多方面挑戰(zhàn)。低豐度修飾的信號常被噪聲淹沒，導(dǎo)致檢測靈敏度不足；訓(xùn)練數(shù)據(jù)匱乏使模型泛化能力有限，難以適應(yīng)不同物種或條件；相鄰或共存修飾的信號重疊以及 RNA 結(jié)構(gòu)、測序速度等因素造成的復(fù)雜擾動，使修飾識別更加困難。此外，缺乏統(tǒng)一、可靠的驗證數(shù)據(jù)集和評估標準，導(dǎo)致不同工具結(jié)果難以直接比較。盡管如此，DRS 的潛力正在逐步顯現(xiàn)，其應(yīng)用正從方法驗證走向真實的生物學(xué)與醫(yī)學(xué)場景。研究者已利用 DRS 在單次測序中識別多種修飾（如 m6A、Ψ、m5C 等），并揭示植物脅迫響應(yīng)、白血病甲基化差異及微生物m6A圖譜等現(xiàn)象，為理解修飾調(diào)控提供了新的視角。展望未來，DRS 驅(qū)動的 RNA 修飾研究將繼續(xù)向單分子精度和多修飾聯(lián)合建模方向發(fā)展，通過信號解卷積、結(jié)構(gòu)感知和深度學(xué)習(xí)進一步提升識別能力。修飾檢測將逐步與 basecalling 過程融合，實現(xiàn)實時、準確的分析，并與蛋白質(zhì)組學(xué)、空間轉(zhuǎn)錄組和單細胞組學(xué)結(jié)合，構(gòu)建多維的修飾–功能網(wǎng)絡(luò)。同時，標準化的評測體系與開放數(shù)據(jù)集將提升方法可比性與可靠性。隨著技術(shù)與算法的持續(xù)進步，Nanopore DRS 有望在疾病診斷、RNA 藥物與疫苗設(shè)計等領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)應(yīng)用落地，推動我們從“觀察修飾”邁向“理解并利用修飾”的新階段。

第一作者簡介

劉雅然

劉雅然，理學(xué)博士，濱州醫(yī)學(xué)院講師，主要從事RNA生物標志物的鑒定及疾病進展相關(guān)分子機制的研究。她近期的研究重點在于揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控通路，探索潛在的診斷與治療靶點，并開發(fā)先進的生物信息學(xué)工具，用于分析和解讀復(fù)雜的分子數(shù)據(jù)。她的研究工作結(jié)合了計算方法與實驗生物學(xué)，系統(tǒng)性地探究驅(qū)動腫瘤生長的分子相互作用。相關(guān)研究成果已發(fā)表在Genomics和Genomics, Proteomics & Bioinformatics等國際知名期刊上。

通訊作者簡介

孫強

孫強，理學(xué)博士，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第四醫(yī)院/浙江大學(xué)“一帶一路”國際醫(yī)學(xué)院/浙江大學(xué)國際健康醫(yī)學(xué)研究院特聘副研究員。主要研究方向為腫瘤泛基因組及腫瘤中復(fù)雜剪接事件研究。以第一或通訊作者（含共同）在Cell Systems，Genome Medicine，Analytical Chemistry，Clinical and Translational Medicine及Journal of Molecular Cell Biology等知名國際期刊發(fā)表20余篇學(xué)術(shù)論文，總引1000余次。主持多項國家級、省部級課題，任iMeta，Interdisciplinary Medicine，Cell Proliferation等期刊編委。

李陽

李陽，理學(xué)博士，四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院副研究員，主要研究方向為開發(fā)用于基因編輯的新型分子工具及探究RNA修飾的生物學(xué)功能。以第一或通訊作者（含共同）在Angewandte Chemie International Edition，Cell Systems，Clinical and Translational Medicine及Journal of Molecular Cell Biology等知名國際期刊發(fā)表10余篇學(xué)術(shù)論文。

論文信息

Advances in Detecting RNA Modifications Using Direct RNA Nanopore Sequencing

Yaran Liu, Yang Li, Qiang Sun

Advanced Genetics

DOI:10.1002/ggn2.202500041

https://doi.org/10.1002/ggn2.202500041

掃描二維碼查看文章

更多關(guān)于Advanced Genetics

E-mail:advgenet@wiley.com

Homepage:www.advgenet.com

Advanced Portfolio:

https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/

Social Media：

X:@Adv_Genet

ResearchGate:

https://www.researchgate.net/journal/Advanced-Genetics-2641-6573

Advanced Science News:

https://www.advancedsciencenews.com/

Advanced Portfolio 公眾號

Wiley生命科學(xué)

Wiley生命科學(xué)期刊官方微信平臺

Life-Earth@wiley.com

支持我們，點個“在看”吧！