CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)雖已革新生物醫(yī)學(xué)研究，但臨床轉(zhuǎn)化仍受限于脫靶效應(yīng)與 PAM 序列限制兩大核心挑戰(zhàn) —— 目前廣泛使用的 SpCas9 需識別 “NGG” PAM 序列，難以靶向基因組中大量 AT 富集區(qū)域（如調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的啟動子 TATA 盒），且脫靶風(fēng)險較高【1, 2】。而源自嚙齒類糞桿菌（Faecalibaculum rodentium）的 FrCas9，此前已被發(fā)現(xiàn)具有更高的編輯保真度與 AT 區(qū)域靶向優(yōu)勢【3-5】，但其分子機制長期未明。

近日，胡爭教授團隊在Cell Genomics期刊發(fā)表題為Structural and functional bases ofF.rodentiumCas9 provide insights into CRISPR-Cas protein engineering的研究，該團隊通過冷凍電鏡（cryo-EM）解析FrCas9的關(guān)鍵構(gòu)象，揭示其高保真編輯的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，并基于此開發(fā)出超精準變體eFrCas9，在杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）的基因治療中展現(xiàn)出優(yōu)異潛力，為下一代CRISPR工具的理性設(shè)計提供了分子藍圖。

研究團隊首先通過 cryo-EM 技術(shù)，解析了 FrCas9-sgRNA-DNA 三元復(fù)合物的 R 環(huán)擴展狀態(tài)（RE complex，2.89 ? 分辨率）與預(yù)催化狀態(tài)（PreC complex，3.46 ? 分辨率）結(jié)構(gòu)，這是首次在原子水平上揭示 FrCas9 的動態(tài)工作過程。在 RE 狀態(tài)下，F(xiàn)rCas9 已識別 PAM 序列并啟動 DNA 解旋，形成 15 bp 的 sgRNA-DNA 異源雙鏈與 8 nt 的種子區(qū)，但異源雙鏈仍錨定在 REC2 與 REC3 結(jié)構(gòu)域之間，不同于 SpCas9 沿 REC3-HNH 結(jié)構(gòu)域溝槽延伸的模式，提示其 R 環(huán)擴展機制具有獨特性；而進入 PreC 狀態(tài)后，復(fù)合物進入切割前的準備階段，異源雙鏈在 8-9 bp 與 15-16 bp 處出現(xiàn)超螺旋結(jié)構(gòu)特性，這種結(jié)構(gòu)使 FrCas9 能在與 SpCas9 相近的長度內(nèi)容納 22 bp 的間隔序列（SpCas9 通常為 20 bp），同時壓縮 DNA 主溝至 15.5-15.7 ?，顯著降低對錯配堿基的容忍度，這正是其高保真的核心結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

與 SpCas9 識別 GC-rich 的 “NGG” PAM 不同，F(xiàn)rCas9 通過 PI 結(jié)構(gòu)域（PAM-interaction domain）特異性結(jié)合 5'-NRTA-3' PAM（R 為 A/G），這一特性使其能高效靶向啟動子 TATA 盒等 AT 富集區(qū)域。研究通過結(jié)構(gòu)分析與突變驗證，明確了關(guān)鍵識別機制：PAM 序列的 + 1 位 T（dT1*）通過磷酸骨架與 Y1198 形成氫鍵；+2 位嘌呤（A/G）通過 N1137 的氫鍵識別，若為嘧啶則無法形成有效作用；+3 位 T（dT3*）通過 K1321 的水介導(dǎo)氫鍵結(jié)合；+4 位 A（dA4*）則與 Q1334 形成雙齒氫鍵。當關(guān)鍵識別殘基（如 N1137、Y1198）突變?yōu)楸彼岷?，F(xiàn)rCas9 的 PAM 結(jié)合能力與編輯效率顯著下降，且對 + 2 位嘧啶的識別完全喪失，進一步證實了該作用模式的特異性。

研究團隊進一步聚焦 FrCas9 的磷酸鹽鎖環(huán)（PLL，D1101-V1103），這一區(qū)域是調(diào)控 DNA 結(jié)合與切割效率的關(guān)鍵元件。通過飽和突變篩選與功能驗證，發(fā)現(xiàn) PLL 區(qū)域的 V1103 位點存在電子密度空腔，替換為賴氨酸（V1103K）后，其正電荷側(cè)鏈能更緊密結(jié)合 DNA minor groove。GUIDE-seq 分析顯示，V1103K 突變體的 on-target 效率比野生型 FrCas9 提升 1.2 倍，off-target 事件卻減少 30.15%，且在 9 個靶位點中均未檢測到顯著脫靶。將 V1103K 與 PAM 遠端區(qū)域的 N732A 突變結(jié)合（命名為 eFrCas9），可進一步增強異源雙鏈識別的特異性。

DMD 的主要致病原因是 dystrophin 基因外顯子缺失，其中外顯子 45-55 的缺失占患者總數(shù)的 60%，精準刪除該片段是潛在治愈策略6。研究團隊在人骨骼肌成肌細胞（HsKMM）中驗證 eFrCas9 的治療潛力，通過成對 sgRNA 靶向 intron44 與 intron55，eFrCas9 可實現(xiàn) 43.6-62.1 kb 片段的精準刪除，其中精確刪除效率最高達 17.25%（無indel），若計入含少量 indel 的有效刪除，總效率達 43.91%。相比之下，SpCas9 的精確刪除效率為 0，含 indel 的刪除效率僅 19.21%，且伴隨大量 off-target 事件（每 sgRNA 平均 3.2 個脫靶位點）；而 eFrCas9 在 10 個 sgRNA 中，有 5 個未檢測到脫靶，剩余 5 個僅 1 個脫靶位點，安全性顯著提升。

該研究通過結(jié)構(gòu)解析揭示了 FrCas9 高保真、寬靶向的分子基礎(chǔ)，其發(fā)現(xiàn)的 “PLL 工程化 + PAM 遠端優(yōu)化” 策略為 CRISPR 工具的理性設(shè)計提供了通用范式。而 eFrCas9 在 DMD 治療中的優(yōu)異表現(xiàn)，不僅證實了其臨床轉(zhuǎn)化潛力，更為遺傳疾病的精準基因編輯開辟了新路徑 —— 未來有望結(jié)合堿基編輯、引導(dǎo)編輯等技術(shù)，進一步拓展其在腫瘤治療、表觀調(diào)控等領(lǐng)域的應(yīng)用。

原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666979X25002952

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參考文獻

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