海南
前言
南美白對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）占全球蝦養(yǎng)殖量的75%以上，但養(yǎng)殖業(yè)的擴(kuò)大導(dǎo)致疾病增加，尤其是弧菌病。可持續(xù)的解決方案是選擇抗病品種，而不是過(guò)度使用抗生素。一項(xiàng)新研究首次分析了LvLTLC1基因啟動(dòng)子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)SNPs與許多弧菌物種的抗性狀相關(guān)，為選擇品種增加抗性品系蝦苗開辟了方向。
一、材料和方法：
實(shí)驗(yàn)蝦和易感性：從4個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)共采集了200只尾蝦（10g-15g），并在800L的水箱中臨時(shí)飼養(yǎng)。此外，還收集了來(lái)自4個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的308尾個(gè)體作為驗(yàn)證組（VAL）。取肝胰腺樣本（0.1 g）以量化弧菌負(fù)荷（VL）；將肝胰腺和肌肉殘骸儲(chǔ)存在–80°C以供
進(jìn)一步分析。
弧菌負(fù)荷的測(cè)定：將肝胰腺樣品均質(zhì)化、稀釋，然后在TCBS上培養(yǎng)以計(jì)算菌落計(jì)數(shù)（CFU/g）。根據(jù)VL，選擇20名耐弧菌個(gè)體（VR，最低10%）和20名易感個(gè)體（VS，最高10%）進(jìn)行分析。
實(shí)時(shí)PCR和數(shù)據(jù)分析：分離肝胰腺總RNA，合成cDNA，RT-qPCR（β-actin作為參考基因）定量LvLTLC1基因表達(dá)。使用Pearson相關(guān)系數(shù)（SPSS 27.0）分析LvLTLC1 mRNA表達(dá)與VLs mRNA表達(dá)之間的相關(guān)性。
PCR擴(kuò)增和測(cè)序：分離VR組和VS組各20例DNA的DNA，擴(kuò)增至LvLTLC1啟動(dòng)子區(qū)，采用SnapGene 6軟件對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳、測(cè)序和SNP鑒定。
SNP和單倍型分析：比較兩組之間的SNP基因型。選取差異明顯的SNPs（P < 0.05）分析與綜合耐弧菌（PVR）性狀的關(guān)聯(lián)。使用Haploview分析不平衡（LD） 鏈路。
Val確認(rèn)：VAL組中的308名個(gè)體通過(guò)PCR進(jìn)行基因分型，并測(cè)序以確認(rèn)SNP/單倍型與PVR之間的關(guān)聯(lián)。遺傳多樣性參數(shù)（Ne，Ho，He，等位基因頻率，PIC）使用Popgene 32計(jì)算。使用SHEsis PLUS進(jìn)行Hardy-Weinberg測(cè)試。
預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子 （TF） 的附著位置：使用貼片系統(tǒng)和JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)分析啟動(dòng)子區(qū)域中的核心調(diào)節(jié)元件。預(yù)測(cè)評(píng)分為 >85%的TF被認(rèn)為可用于評(píng)估基因調(diào)控中的潛在作用。
二、VR組和VS組PVR性狀表達(dá)及LvLTLC1基因水平結(jié)果
根據(jù)肝胰腺VLs，篩選出20例耐弧菌個(gè)體（VR、VLs<10? CFU/g）和20例易感個(gè)體（VS、VLs>10? CFU/g）。結(jié)果顯示，肝胰胰組VR的LvLTLC1基因表達(dá)水平明顯高于VS組。此外，LvLTLC1表達(dá)與VL呈負(fù)相關(guān)，證實(shí)了該基因在弧菌耐藥機(jī)制中的重要作用。
圖1. VS和VR組中的 VL。（A）VR組和VS組的VL統(tǒng)計(jì)。（B） VR和VS組典型個(gè)體的 VL。
圖2. VS組和VR組LVLTLC1基因的mRNA表達(dá)及其與VL的相關(guān)性。（A）VS組和VR組LvLTLC1基因表達(dá)。（B）基因表達(dá)與VL的相關(guān)性分析。
1、LvLTLC1啟動(dòng)子區(qū)SNPs的檢測(cè)及與PVR性狀的關(guān)聯(lián)：
與LvLTLC1參考序列相比，VR組和VS組鑒定出24個(gè)SNP位點(diǎn)不同，均位于潛在轉(zhuǎn)錄因子集中的500 bp啟動(dòng)子區(qū)域。其中，只有SNP8 （g.–256 A/G） 和SNP16 （g.–116 A/G） 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因型差異。值得注意的是，SNP8的GG純合基因型僅出現(xiàn)在三個(gè)VR實(shí)例中，并且不存在于VS組中。相比之下，SNP16雖然在兩組之間不同，但沒有PVR相關(guān)基因型；SNP16的AG基因型與易感性狀相關(guān)，見于91.6%的VS個(gè)體。因此，SNP16不是PVR性狀的可靠指標(biāo)，但可能與易感性有關(guān)。在所有SNPs中，SNP8的P值最低，表明SNP8的GG純合基因型是與蝦中綜合抗弧菌（PVR）性狀相關(guān)的分子指標(biāo)的潛在候選者。
圖3. 引導(dǎo)區(qū)的4個(gè)SNP位點(diǎn)在VR組和VS組中具有不同的基因型。
2、LvLTLC1啟動(dòng)子區(qū)單倍型及與PVR性狀的相關(guān)性分析：
LD分析表明，SNP9和SNP10具有高度的關(guān)聯(lián)性，因此將這兩種SNP的單倍型納入與PVR性狀相關(guān)的分析中。結(jié)果記錄了5例攜帶TG單倍型的個(gè)體，其中4個(gè)個(gè)體（80%）屬于VR組，只有1個(gè)個(gè)體（20%）屬于VS組。這表明TG單倍型與弧菌抗性有關(guān)，并可能作為蝦PVR性狀的潛在分子指標(biāo)。
3、基于SNP8的VAL組遺傳多樣性參數(shù)：
以308尾蝦個(gè)體為基礎(chǔ)的VAL組進(jìn)行SNP8的遺傳多樣性分析，與PVR性狀的關(guān)聯(lián)最強(qiáng)。基因分型結(jié)果用于計(jì)算等位基因頻率和遺傳參數(shù)，檢驗(yàn)表明SNP8遵循 Hardy-Weinberg 平衡 （HWE）。同時(shí)，SNP8的多態(tài)性水平較低（PIC < 0.25），反映出該位點(diǎn)的遺傳變異很少見，與PVR性狀在蝦種群中本質(zhì)上罕見的觀察結(jié)果一致。這些結(jié)果加強(qiáng)了SNP8的遺傳基礎(chǔ)，表明它是PVR性狀的潛在分子標(biāo)記。
圖4. LvLTLC1基因起始區(qū)24個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型。紅色表示強(qiáng)LD，方形表示 LD SNP。
4、驗(yàn)證VAL組候選基因型/單倍型與PVR性狀之間的關(guān)聯(lián)：
在308尾個(gè)體的VAL組中，PVR性狀根據(jù)弧菌負(fù)荷（VLs）分為10個(gè)目，范圍從103到1.65×10? CFU/g，標(biāo)準(zhǔn)分布，經(jīng)Q-Q檢驗(yàn)確認(rèn)。這表明PVR性狀多種多樣，從強(qiáng)抵抗力到易感性，但極端情況很少見。SNP8基因型分析顯示，3種基因型VLs差異明顯（P < 0.01）。攜帶G等位基因（AG 或 GG）的個(gè)體的VL明顯低于 AA，并且VL隨著G等位基因數(shù)量的增加而減少。特別是，GG基因型與極低水平的VL （<10? CFU/g） 相關(guān)，表現(xiàn)出高耐藥性。對(duì)于SNP9和SNP10，VAL組的LD分析顯示強(qiáng)烈的結(jié)合失衡（D' = 0.922）。TG單倍型的VL明顯低于其他單倍型，特別是當(dāng)TT/GG組合時(shí)，具有該基因型的兩個(gè)個(gè)體被歸類為具有VLs<10? CFU/g的PVR。TT/AG基因型的VL也低于大多數(shù)其他單倍型，盡管高于 TT/GG。結(jié)果表明，SNP10的純合狀態(tài)在SNP9-SNP10結(jié)合作用中起重要作用。綜上所述，SNP8（特別是GG基因型）和TG單倍型（SNP9-SNP10）是與斑節(jié)對(duì)蝦綜合抗弧菌（PVR）性狀相關(guān)的潛在分子標(biāo)記。
圖5. VL VAL組中的分布。（A） VL 頻率圖。隨著顏色變深，感染也會(huì)增加。（B） 標(biāo)準(zhǔn)配電檢查的Q-Q圖表。
圖6. VAL組基因型、單倍型和VL之間的相關(guān)性。（A）VL與SNP8（B）VL中不同基因型個(gè)體的分布以及SNP9和SNP10中不同單倍型個(gè)體的分布。
圖7. SNP9和SNP10的TG單倍型的基因型組合與VL有關(guān)?；蛐徒M合后面括號(hào)中的數(shù)字表示個(gè)體的大小。
5、SNP突變改變轉(zhuǎn)錄因子 （TF） 的內(nèi)聚模式：
JASPAR的預(yù)測(cè)分析（相對(duì)評(píng)分>0.85）表明，LvLTLC1啟動(dòng)子區(qū)域的SNP變異導(dǎo)致能夠附著在基序上（TFBS）的TF數(shù)量和類型發(fā)生變化。在 SNP8 （g.–256） 中，A等位基因產(chǎn)生四個(gè)預(yù)測(cè)的TF，屬于三個(gè)家族（FAEOB II、MYB62、STAT3 和 MOT3），而G等位基因產(chǎn)生三個(gè)完全不同的 TF（STAT3、Fox A-b、tbx-37）。在 SNP9 （g.–249） 處，T等位基因產(chǎn)生三個(gè)家族的四個(gè)TF，而G等位基因產(chǎn)生兩個(gè)家族的5個(gè)TF，包括具有擴(kuò)展結(jié)合位點(diǎn)的TF DOF5.7。在SNP10 （g.–235） 中，A等位基因產(chǎn)生兩個(gè)家族的四個(gè)TF，但G等位基因只有兩 TF。值得注意的是，SNP10中的A→G轉(zhuǎn)化也改變了TF STAT3識(shí)別基序序列。這些結(jié)果表明，啟動(dòng)子區(qū)域的SNPs可以改變TF附著模式，從而影響對(duì)蝦LvLTLC1基因表達(dá)和PVR性狀的調(diào)控。
圖8. 轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)分析。（A）與含有SNP8、SNP9和SNP10的基序相關(guān)的多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族。（B）SNP影響同一家族的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序。
三、結(jié)束：
本研究首先研究了南美白對(duì)蝦LvLTLC1基因啟動(dòng)子區(qū)的SNP，共檢測(cè)到24個(gè)SNP位點(diǎn)。特別是，SNP8的GG純合基因型 （g.–256 A/G） 與較強(qiáng)的弧菌抗性密切相關(guān)。LD分析表明，SNP9（g.–249 T/G）和SNP10（g.–235 A/G）高度相關(guān)，TT/GG基因型組合具有明顯的內(nèi)聚力和較強(qiáng)的抗性。因此，將SNP8的GG基因型和SNP9和SNP10的TT/GG組合確定為綜合抗弧菌（PVR）的2個(gè)潛在分子標(biāo)記，在對(duì)蝦遺傳品種的選擇中具有應(yīng)用價(jià)值。
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