核受體4A1（NR4A1，也稱為Nur77，TR3）是必需的核受體超家族成員。新興證據(jù)表明NR4A1是炎癥和增殖的雙重調(diào)節(jié)因子，對腎臟病理生理學有重要影響。然而，它在MsPGN相關(guān)炎癥和MCs增殖中的作用尚不明確。截至目前，尚未發(fā)現(xiàn)NR4A1的明確內(nèi)源性配體，因此將其命名為孤兒受體。然而，一些小分子化合物——例如Cytosporone B (CsnB)——已被證明可以結(jié)合NR4A1的LBD并調(diào)節(jié)其活性。因此，鑒定可以結(jié)合NR4A1的天然小分子配體具有重要意義。

Bruceine A （BA）是一種從鴉膽子中提取的天然化合物，具有與MsPGN致病因子一致的生物活性。除了其在糖尿病腎病中的抗炎作用外，BA還具有獨特的抗病毒特性和雙重抗腫瘤作用然而，其調(diào)節(jié)MCs炎癥和增殖的能力仍未被探索。

2025年12月5日，廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院中醫(yī)證候國家重點實驗室潘胡丹/劉良院士團隊、中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心腎內(nèi)科陳香美院士在STTT（IF 52.7）發(fā)表題為“Bruceine A protects nuclear receptor 4A1 from ubiquitin-degradation to alleviate mesangial proliferative glomerulonephritis”的文章。鴉膽子苦素 A（BA）與 NR4A1 的 D481/Q568 位點結(jié)合，并在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出 NR4A1 依賴性的抗炎和抗增殖作用。BA 與 NR4A1 的 LBD 結(jié)合（通過 D481/Q568），從而在 K558 處通過空間位阻阻止 K48 連接的多泛素化，并穩(wěn)定 NR4A1 蛋白水平。這種穩(wěn)定使 NR4A1 能夠自激活其啟動子，增強 NF-κB 的轉(zhuǎn)錄抑制，最終減弱炎癥級聯(lián)反應(yīng)和系膜增生，從而賦予腎臟保護作用。

摘要

核受體 4A1（NR4A1）在維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，并參與多種疾病過程；然而，其在系膜增生性腎小球腎炎（MsPGN）中的功能作用和藥理學潛力尚未得到探索。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn) NR4A1 的下調(diào)通過調(diào)節(jié)系膜細胞（MCs）的炎癥和增殖反應(yīng)來促進 MsPGN 的發(fā)病機制，而 NR4A1 的過表達則會逆轉(zhuǎn)這些過程。鴉膽子苦素A（BA）與 NR4A1 的 D481/Q568 位點結(jié)合，并在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出 NR4A1 依賴性的抗炎和抗增殖作用。值得注意的是，腺相關(guān)病毒 9 型（AAV9）介導的 NR4A1 過表達可減輕腎小球損傷和炎癥級聯(lián)反應(yīng)，而敲除 NR4A1 則會削弱 BA 的腎保護作用。BA 與 NR4A1 的配體結(jié)合域（LBD）結(jié)合，并進一步通過空間阻斷 K48 聯(lián)合多聚泛素化在 K558 位點處阻斷，從而穩(wěn)定 NR4A1 蛋白水平。這種穩(wěn)定狀態(tài)使得 NR4A1 能夠自動激活自身的啟動子，增強核因子κB（NF-κB）信號通路磷酸化的轉(zhuǎn)錄抑制作用，從而最終抑制炎癥級聯(lián)反應(yīng)和系膜細胞增殖，實現(xiàn)腎臟保護。這項研究為開發(fā)針對膜性腎小球腎炎的下一代療法提供了一條有前景的治療途徑。

BA通過抑制K48連接的多泛素化在K558來穩(wěn)定NR4A1，從而改善MsPGN。 (左) 在病理條件下，K48連接的多泛素化介導NR4A1的降解，從而影響其自調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性。隨后的NF-κB激活促進炎癥細胞因子釋放和MCs增殖，加重腎損傷。 (右) BA抑制K48連接的多泛素化在K558，穩(wěn)定NR4A1。這恢復(fù)了NR4A1介導的轉(zhuǎn)錄自放大和NF-κB抑制，減輕炎癥和系膜增生，從而提供腎臟保護

1.NR4A1 下調(diào)通過調(diào)節(jié)MC中的炎癥和增殖反應(yīng)來促進IgAN的進展

NR4A1在IgAN進展中作為一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用，通過協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)炎癥信號和增殖反應(yīng)來促進發(fā)病機制。

圖1 NR4A1的下調(diào)通過調(diào)節(jié)MC中的炎癥和增殖反應(yīng)來促進IgAN的進展

2.NR4A1 過表達逆轉(zhuǎn)了 MC 的炎癥反應(yīng)和增殖

NR4A1過表達通過抑制系膜炎癥和增殖來減緩疾病進展。

圖2 NR4A1過表達逆轉(zhuǎn)了MCs的炎癥反應(yīng)和增殖

3.BA與NR4A1結(jié)合親和力高，并形成緊密的相互作用

為了識別與NR4A1結(jié)合的候選化合物，從傳統(tǒng)中醫(yī)藥（TCM）數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻中選擇了超過20種腎保護化合物進行分子對接分析。分子對接結(jié)果表明，BA理論上對NR4A1表現(xiàn)出很強的結(jié)合親和力（親和力?=??8.00?kcal/mol），并且像CsnB一樣，結(jié)合在NR4A1的同一口袋內(nèi)。具體來說，BA在NR4A1的LBD中與谷氨酰胺568 (Q568) 和天冬氨酸481 (D481) 形成多達四個氫鍵，表明增強的結(jié)合穩(wěn)定性（圖3a）。

為了進一步確認BA是否與NR4A1結(jié)合，我們在體外進行了CETSA和DARTS實驗。結(jié)果表明，BA以劑量依賴的方式保護NR4A1免受蛋白水解和高溫降解（圖3b, c）。同時，人類蛋白質(zhì)組微陣列篩選獨立驗證了NR4A1作為BA結(jié)合靶點（圖3d）。值得注意的是，我們還使用SPR、MST和BLI實驗驗證了BA和NR4A1之間的結(jié)合親和力。MST結(jié)果顯示出Kd值為12.42?±?1.55?μM（圖3e），而SPR和BLI分析分別顯示出Kd值為3.62?×?10?? M和9.69?×?10???M（圖3f) 為了確定BA-NR4A1的結(jié)合特異性，我們根據(jù)對接預(yù)測生成了NR4A1突變體（D481A和Q568A），并進行了MST和SPR實驗。顯著的是，D481A/Q568A突變顯著降低了結(jié)合親和力，MST Kd增加到204.83?±?17.06?μM（圖3g）和SPR Kd增加到3.84?×?10???M（圖3h），確認這些殘基為關(guān)鍵的相互作用位點?？傊@些結(jié)果表明BA結(jié)合在NR4A1 LBD的D481和Q568。

圖3 BA與NR4A1具有高親和力并形成緊密的相互作用

4.BA通過NR4A1減輕抗thy1大鼠腎炎模型的蛋白尿和病理改變

圖4 BA對蛋白尿和病理變化的影響

5.BA通過NR4A1/NF-κB信號通路抑制MCs增殖和炎癥

圖5 BA在體外抑制MCs的增殖和炎癥

6.BA在體外以競爭性方式與CsnB結(jié)合到NR4A1上并且在體內(nèi)

圖6 BA以競爭性方式與CsnB結(jié)合于體外和體內(nèi)NR4A1

7.BA 緩解依賴 NR4A1 的抗 Thy1 腎炎

圖7 BA依賴于NR4A1緩解抗thy1腎炎

8.BA通過抑制K48連接的多泛素化修飾來穩(wěn)定NR4A1，從而賦予腎臟保護作用

圖8 BA通過抑制K48連接的泛素化修飾K558來穩(wěn)定NR4A1，從而提供腎保護

結(jié)論

我們證明了天然化合物BA通過特異性抑制K48連接的泛素化在K558，從而穩(wěn)定NR4A1并抑制NF-κB驅(qū)動的炎癥來賦予腎臟保護作用。重要的是，我們建立了一種“蛋白質(zhì)穩(wěn)定化”的治療模式，超越了傳統(tǒng)的受體激活策略，解決了經(jīng)典NR4A1激動劑的局限性。這些發(fā)現(xiàn)不僅推進了我們對核受體在腎病中調(diào)控的理解，還為在其他病理條件下靶向蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)提供了框架，為開發(fā)新的腎病藥物提供了新的見解。

https://www.nature.com/articles/s41392-025-02495-2

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