人類中腦多巴胺能神經(jīng)元體外分化在帕金森病病理模型構(gòu)建與臨床細(xì)胞治療中均起到重要作用。然而不同體外分化體系在轉(zhuǎn)錄水平上與體內(nèi)組織的相似性缺乏可靠的衡量標(biāo)準(zhǔn)。

近日，新加 坡國立大學(xué)杜克國大醫(yī)學(xué)院 (Duke-NUS Medical School)Alfred Sun課題組與John Ouyang課題組在Science Advances期刊發(fā)表了題為BrainSTEM: A single-cell multi-resolutionfetalbrain atlas reveals transcriptomic fidelity of human midbrain cultures的論文。該研究建立了多分辨率的人胚胎全腦圖譜和人胚胎中腦圖譜，用于更精準(zhǔn)地表征體外中腦培養(yǎng)體系的轉(zhuǎn)錄組特征和區(qū)域純度，并提出了雙層投射框架 BrainSTEM：先將數(shù)據(jù)映射至全腦圖譜以識(shí)別腦區(qū)來源，再將預(yù)測(cè)為中腦的細(xì)胞投射到高分辨率的中腦亞圖譜，從而揭示包括稀有亞群在內(nèi)的多樣細(xì)胞類型。

首先，作者構(gòu)建了兩個(gè)單細(xì)胞人腦圖譜，即人胚胎全腦圖譜和人胚胎中腦圖譜。作者對(duì) Braun et al. (Science, 2023) 與 Zeng et al. (Cell Stem Cell, 2023) 報(bào)道的單細(xì)胞人腦數(shù)據(jù)集隨機(jī)下采樣，并利用 RPCA 方法進(jìn)行數(shù)據(jù)集整合，構(gòu)建了包含 39 位捐獻(xiàn)者、67 萬余個(gè)細(xì)胞，時(shí)間跨度從受精后 3 周到 14 周的人胚胎全腦圖譜。經(jīng)過統(tǒng)一細(xì)胞類型注釋和標(biāo)志基因鑒別，作者共鑒定出 23 種細(xì)胞類型，包括神經(jīng)元、神經(jīng)祖細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞。其中神經(jīng)元進(jìn)一步分為 10 種亞型，既有傳統(tǒng)以神經(jīng)遞質(zhì)劃分的多巴胺能 (DA)、 膽堿能、GABA能、谷氨酸能和 5-羥色胺能神經(jīng)元，也有基于標(biāo)志基因標(biāo)注的亞型。

為了探索細(xì)胞的腦區(qū)特異性，作者基于區(qū)域標(biāo)注訓(xùn)練了 kNN 分類器，發(fā)現(xiàn)多種神經(jīng)元和神經(jīng)祖細(xì)胞在前腦、中腦和后腦表現(xiàn)出獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄特征。例如，中腦 DA 神經(jīng)元和前腦谷氨酸能神經(jīng)元具有極高的區(qū)域特異性，而前腦 5-羥色胺能神經(jīng)元?jiǎng)t缺乏明顯的特征信號(hào)。放射狀膠質(zhì)細(xì)胞在前腦特異表達(dá) EMX2、FOXG1，中腦對(duì)應(yīng) EN1，后腦則由 HOX 基因家族標(biāo)記。研究發(fā)現(xiàn)了新的 DA 神經(jīng)元區(qū)域特異性標(biāo)志基因，如 ELOVL3、MYRIP 與中腦 DA 神經(jīng)元的身份密切相關(guān)。整體上，不同神經(jīng)元的區(qū)域特征基因重疊較少，顯示各腦區(qū)發(fā)育具有高度專一性。

進(jìn)一步，作者從全腦圖譜中提取出中腦相關(guān)數(shù)據(jù)，并與 Birtele et al. (Development, 2022) 報(bào)道的中腦數(shù)據(jù)集相結(jié)合，構(gòu)建了迄今規(guī)模最大的人胚胎中腦的單細(xì)胞圖譜。該數(shù)據(jù)集整合了 Braun et al.、Zeng et al. 以及 Birtele et al. 的最新數(shù)據(jù)，共計(jì) 10 萬余個(gè)細(xì)胞，時(shí)間跨度為受精后 3 周到 14 周。在該圖譜中，他們識(shí)別出多種中腦細(xì)胞類型，包括多個(gè)神經(jīng)元類型與其對(duì)應(yīng)的神經(jīng)祖細(xì)胞亞群，如谷氨酸能、背/腹側(cè) GABA 能、紅核 (hRN)、多巴胺能神經(jīng)元 (hDA) 以及視丘下核 DA 神經(jīng)元 (hDA.STN) 等。針對(duì)中腦腹側(cè)相關(guān)細(xì)胞進(jìn)行的擬時(shí)間序列分析揭示了這些細(xì)胞類型間的譜系關(guān)系：hRN、hDA 和 hDA.STN 可能源自共同的中間祖細(xì)胞 hNProg.DARN，值得注意的是，這也是首次在中腦圖譜中檢出 hDA.STN 細(xì)胞群；而LMX1A、RGS4 等標(biāo)志基因在該譜系中呈現(xiàn)出的動(dòng)態(tài)變化，也提示 hDA.STN與 hDA 神經(jīng)元具有發(fā)育上的密切聯(lián)系。

基于上述的兩個(gè)單細(xì)胞人腦圖譜，作者提出了 BrainSTEM 雙層投射框架：第一層投射是將體外分化的單細(xì)胞數(shù)據(jù)投射到人胚胎全腦圖譜，以判斷這些細(xì)胞屬于哪個(gè)腦區(qū)和哪一類細(xì)胞；第二層投射則是在第一層結(jié)果中篩選出預(yù)測(cè)為中腦身份的細(xì)胞，再將它們投射到人胚胎中腦圖譜，從而獲得高分辨率與保真度的亞群分類。這樣的兩步設(shè)計(jì)避免了單純依賴中腦參考導(dǎo)致的“過度預(yù)測(cè)”，也能有效檢測(cè)出培養(yǎng)體系中混雜的非中腦細(xì)胞，從而更真實(shí)地反映培養(yǎng)體系的區(qū)域純度。與傳統(tǒng)的一步映射（Direct Mapping）相比，BrainSTEM 在識(shí)別細(xì)胞區(qū)域來源上更準(zhǔn)確，也更能揭示體外體系中的“雜質(zhì)”細(xì)胞成分。

利用 BrainSTEM 框架，作者系統(tǒng)性地評(píng)估了體外分化的中腦單細(xì)胞數(shù)據(jù)。本研究納入的查詢數(shù)據(jù)集包括了一個(gè)來源于 Alfred Sun 課題組的數(shù)據(jù)集，以及經(jīng)詳盡檢索可獲取的已公開發(fā)表的體外分化中腦單細(xì)胞數(shù)據(jù)，共計(jì) 13 個(gè)數(shù)據(jù)集，超過 140 萬個(gè)細(xì)胞，涵蓋 2D 與 3D 培養(yǎng)體系以及帕金森病相關(guān)模型。分析發(fā)現(xiàn)，幾乎所有體系都存在不同程度的非中腦細(xì)胞“污染”，某些數(shù)據(jù)集中預(yù)測(cè)為前腦或后腦來源的神經(jīng)元比例甚至超過一半。這說明雖然這些分化體系能夠生成目標(biāo)的 DA 神經(jīng)元，但區(qū)域純度仍在較低水平。比較發(fā)現(xiàn)，大部分體系在分化第 30–40 天出現(xiàn)中腦身份細(xì)胞比例的高峰。3D類器官方案在中腦純度上并不一定優(yōu)于 2D 培養(yǎng)，而一些 2D 體系在晚期也能產(chǎn)生較高比例的中腦身份細(xì)胞，但這些細(xì)胞大多仍停留在祖細(xì)胞階段而非成熟神經(jīng)元。

在第一層投射中預(yù)測(cè)為中腦細(xì)胞的數(shù)目超過 1000 的 7 個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)入了第二層投射。結(jié)果顯示，不同體外分化體系在生成 hDA 及其祖細(xì)胞之余，也生成了不同數(shù)量的腹側(cè) GABA 能神經(jīng)元與其祖細(xì)胞、谷氨酸能神經(jīng)元與其祖細(xì)胞。BrainSTEM 報(bào)道的腹側(cè)細(xì)胞指數(shù)也側(cè)面印證了細(xì)胞分類預(yù)測(cè)結(jié)果。作者還發(fā)現(xiàn)，在不同中腦分化體系中，諸如生長因子 FGF8 的使用和 CHIR 濃度的差異，會(huì)顯著影響 hDA 的產(chǎn)量。在一魚藤酮誘導(dǎo)帕金森病模型中，第二層投射得到的 hDA 細(xì)胞群相對(duì)于對(duì)照組顯示了小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因富集，說明 BrainSTEM 可用于支持帕金森病病理機(jī)制相關(guān)研究。

通過 BrainSTEM 雙層投射框架，作者不僅驗(yàn)證了當(dāng)前中腦分化體系在純度和成熟度上的不足，也提供了一個(gè)量化和比較不同體系的通用標(biāo)準(zhǔn)。BrainSTEM 的 R 包和數(shù)據(jù)庫已經(jīng)上線。未來研究者可以利用該工具便捷地評(píng)估自己的培養(yǎng)體系，判斷生成的DA 神經(jīng)元是否真正具備中腦區(qū)域身份，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并減少非目標(biāo)區(qū)域的細(xì)胞“污染”。這對(duì)于優(yōu)化帕金森病模型、改進(jìn)干細(xì)胞治療中的神經(jīng)分化策略，都具有重要價(jià)值。

新加坡國立大學(xué)杜克國大醫(yī)學(xué)院 Alfred Sun 與 John Ouyang 為本研究的共同通訊作者。新加坡國立大學(xué)杜克國大醫(yī)學(xué)院 Hilary Toh、Lisheng Xu 是本研究的共同第一作者。悉尼大學(xué) Pengyi Yang、Carissa Chen 亦對(duì)本研究作出了重要貢獻(xiàn)。

原文鏈接：www.science.org/doi/pdf/10.1126/sciadv.adu7944

Alfred Sun實(shí)驗(yàn)室4年前建于新加坡杜克國大醫(yī)學(xué)院神經(jīng)系，主要利用人類神經(jīng)細(xì)胞，類腦模型等研究退行性神經(jīng)疾病和神經(jīng)發(fā)育疾病，同時(shí)也開發(fā)新的神經(jīng)細(xì)胞模型，聚焦于最終的臨床轉(zhuǎn)化。歡迎有志同道合的同學(xué)和朋友加入。

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