牙周炎是一種由牙周病原體引起的炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為牙齦出血、牙周袋加深、牙齒松動甚至脫落，最終導(dǎo)致牙槽骨缺損。在侵襲性牙周炎中，獨特的炎癥微環(huán)境涉及細菌病原體招募和激活免疫細胞，釋放活性氧，引發(fā)氧化失衡，誘導(dǎo)細胞凋亡，降低干細胞活性，抑制成骨細胞功能并促進破骨細胞生成。盡管已有多種生物材料被開發(fā)用于牙周骨再生，但現(xiàn)有策略往往難以同時應(yīng)對免疫失調(diào)、氧化損傷和骨丟失等多重障礙，使得牙周骨組織的完整重建仍面臨巨大挑戰(zhàn)。

近日，同濟大學(xué)范震主任醫(yī)師、上海交通大學(xué)胥春主任醫(yī)師合作提出了一種名為HTF@HA的可注射多功能水凝膠，其通過動態(tài)硼酸酯交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)環(huán)境響應(yīng)與時間控制釋放生物活性因子。該水凝膠在酸性和氧化條件下更快降解，優(yōu)先釋放抗氧化和抗炎成分，促進巨噬細胞向M2表型極化并緩解炎癥；在后續(xù)修復(fù)階段，通過鈣-磷酸相互作用介導(dǎo)濃縮生長因子和低劑量骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的持續(xù)釋放，支持成骨分化和血管生成。體外實驗顯示，HTF@HA具有高生物相容性、抗氧化與抗炎能力，并能顯著增強牙周膜干細胞成骨和內(nèi)皮細胞血管生成。動物實驗進一步證實，該水凝膠能促進新骨和血管形成，且在BMP-2劑量僅為50 μg/L時，其骨再生效果與高劑量500 μg/L相當。相關(guān)論文以“Environmental Response Temporal Release Injectable Hydrogel for Controlled Growth Factor Release to Enhance Inflammatory Periodontal Bone Defect Regeneration”為題，發(fā)表在

Advanced Materials

研究通過示意圖1系統(tǒng)展示了HTF@HA水凝膠的組成與合成路徑、CGF的制備與外源性BMP-2的加載過程，以及在大鼠牙周骨缺損模型中的局部注射應(yīng)用。該水凝膠在牙周炎癥微環(huán)境中表現(xiàn)出清除ROS、抑制M1巨噬細胞并促進M2極化的抗炎機制，其分子機制與調(diào)控NF-κB信號通路密切相關(guān)，同時通過細胞外基質(zhì)相互作用和增強線粒體能量代謝促進干細胞成骨分化。圖1進一步評估了水凝膠的物理化學(xué)性質(zhì)，包括其宏觀形態(tài)、可注射性、微觀結(jié)構(gòu)、元素分布、化學(xué)結(jié)構(gòu)確認、降解行為、孔隙率、溶脹性能及流變特性，顯示出優(yōu)異的剪切稀化、自愈合與可控降解能力。

示意圖1. （A）HB、HBT、HTF與HTF@HA水凝膠的組成與合成路徑示意圖；（B）CGF制備流程：包括志愿者采血、差速離心及外源性BMP-2的添加；（C）動物模型構(gòu)建與HTF@HA水凝膠注射；（D）水凝膠系統(tǒng)在牙周微環(huán)境中的ROS清除功能；（E）水凝膠系統(tǒng)抗炎機制示意圖：抑制M1巨噬細胞極化并促進M2極化；（F）水凝膠系統(tǒng)抗炎機制通路圖：通過調(diào)控NF-κB通路實現(xiàn)抗炎作用；（G）水凝膠系統(tǒng)通過細胞外機制途徑促進牙周膜細胞成骨分化；（H）水凝膠系統(tǒng)通過增強線粒體能量供應(yīng)促進牙周膜細胞成骨分化。

圖1 水凝膠的物理化學(xué)性質(zhì)評估 （A）HB、HBT、HTF與HTF@HA水凝膠在玻璃瓶中的宏觀形態(tài)；（B）HTF@HA水凝膠的可注射性示意圖；（C）水凝膠微觀結(jié)構(gòu)的SEM圖像（比例尺：20與100 μm）；（D,E）EDS測量的HTF@HA水凝膠元素組成；（F）質(zhì)子核磁共振（1H NMR）譜圖；（G）FTIR光譜揭示水凝膠樣品間官能團變化；（H）水凝膠在PBS中的體外降解曲線；（I）水凝膠孔隙率測量；（J）HTF@HA水凝膠在10與20 μM過氧化氫濃度下的體外降解曲線；（K）HTF@HA水凝膠在pH 5.5與8.0條件下的體外降解曲線；（L）HTF@HA水凝膠在PBS、過氧化氫與酸性條件同時存在下的體外降解曲線；（M）三種水凝膠的溶脹行為；（N）水凝膠的流變性質(zhì)。

圖2集中展示了水凝膠的生物相容性與抗氧化性能。通過活/死細胞染色與CCK-8實驗證實HTF@HA能有效緩解炎癥環(huán)境下牙周膜干細胞的損傷并促進其增殖。電子順磁共振與紫外-可見分光光度法顯示該水凝膠對DPPH和羥基自由基具有高效清除能力，抗氧化性能隨濃度增加而增強。圖3則深入探討了其抗炎機制與細胞遷移促進作用。水凝膠處理顯著降低了M1型巨噬細胞標志物（IL-6、TNF-α、iNOS）的mRNA表達，并提升了M2型標志物（CD206、Arg-1、IL-10）的表達，免疫熒光結(jié)果進一步驗證了其對M2極化的促進。此外，Transwell與劃痕實驗表明，HTF@HA能顯著恢復(fù)炎癥環(huán)境下牙周膜干細胞和內(nèi)皮細胞的遷移能力。

圖2 水凝膠的生物相容性與抗氧化性能評估 （A,B）水凝膠的流變性質(zhì)；（C）應(yīng)力-應(yīng)變曲線；（D）水凝膠的最大壓縮強度；（E）水凝膠的壓縮模量；（F）HTF@HA水凝膠中BMP-2的體外釋放曲線；（G）通過活/死細胞染色評估水凝膠的細胞相容性（比例尺：50 μm）；（H）使用CCK-8 assay在不同時間點測量的細胞活力；（I）DPPH自由基的ESR譜圖；（J）HTF@HA水凝膠對DPPH自由基的清除效率；（K）DPPH自由基清除過程中的顏色變化；（L）?OH自由基的ESR譜圖；（M）HTF@HA水凝膠對?OH自由基的清除效率；（N）?OH自由基清除過程中的顏色變化。

圖3 水凝膠的抗炎特性及其對細胞遷移能力的影響 （A,B）使用DCFH-DA熒光探針檢測的細胞內(nèi)ROS水平定量分析及熒光強度（比例尺：20 μm）；（C–H）炎癥相關(guān)基因（IL-6、TNF-、iNOS、CD206、Arg-1與IL-10）的mRNA表達水平；（I）水凝膠抗炎功能示意圖；（J–M）IL-6與Arg-1表達的免疫熒光圖像及定量分析（比例尺：20 μm）；（N,O）經(jīng)水凝膠處理的PDLSCs的Transwell遷移圖像及定量分析（比例尺：20 μm）；（P,Q）PDLSCs水平遷移的劃痕實驗圖像及定量分析（比例尺：50 μm）。

圖4聚焦于水凝膠在炎癥條件下對成骨與血管生成的促進作用。ALP與ARS染色顯示HTF@HA/CGF/BMP-2組能顯著增強牙周膜干細胞的堿性磷酸酶活性與礦化結(jié)節(jié)形成。RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)成骨相關(guān)基因（ALP、OPN、OCN）與血管生成相關(guān)基因（vWF、VEGF、bFGF）表達均顯著上調(diào)。免疫熒光與Western blot進一步證實該復(fù)合水凝膠能促進OPN與RUNX2蛋白表達，并增強HUVECs的血管網(wǎng)絡(luò)形成。圖5通過動物體內(nèi)實驗評估了水凝膠的治療效果。Micro-CT三維重建與BV/TV定量分析顯示，HTF@HA/CGF/BMP-2-50組在低劑量BMP-2下實現(xiàn)了與高劑量ACS/BMP-2-500組相當?shù)墓窃偕Ч&E與Masson染色進一步證實該組新骨結(jié)構(gòu)致密、膠原沉積豐富。

圖4 水凝膠對細胞遷移的影響及其對成骨與血管生成的促進作用 （A,B）HUVECs的Transwell遷移圖像及定量分析（比例尺：20 μm）；（C,D）HUVECs水平遷移的劃痕實驗圖像及定量分析（比例尺：50 μm）；（E）成骨誘導(dǎo)后PDLSCs的ALP染色（比例尺：20 μm）；（F）成骨誘導(dǎo)后PDLSCs的ARS染色（比例尺：50 μm）；（G–I）水凝膠刺激的PDLSCs中成骨相關(guān)基因ALP、OPN與OCN的表達水平；（J,K）經(jīng)水凝膠處理的HUVECs血管網(wǎng)絡(luò)形成的免疫熒光圖像及定量分析（比例尺：50 μm）；（L–N）水凝膠刺激的HUVECs中血管生成相關(guān)基因vWF、VEGF與bFGF的表達水平；（O,P）水凝膠刺激的PDLSCs在成骨誘導(dǎo)期間OPN蛋白表達的免疫熒光圖像及定量分析（比例尺：20 μm）；（Q）水凝膠刺激的PDLSCs在成骨誘導(dǎo)期間OPN與RUNX2蛋白表達的Western blot分析。

圖5 動物實驗的體內(nèi)評估結(jié)果 （A）動物模型構(gòu)建、水凝膠給藥與樣本采集過程示意圖；（B）各組上頜骨的三維micro-CT重建圖像（比例尺：1 mm）；（C）大鼠上頜骨缺損的感興趣區(qū)域（ROI）；（D）micro-CT數(shù)據(jù)中BV/TV的定量分析；（E）上頜骨的H&E染色圖像（比例尺：500, 100 μm）；（F）上頜骨的Masson三色染色圖像（比例尺：500, 100 μm）。

圖6通過免疫熒光染色揭示了水凝膠在體內(nèi)對免疫微環(huán)境與再生過程的調(diào)控。CD206表達上調(diào)與iNOS表達下調(diào)表明水凝膠促進了M2巨噬細胞極化并抑制了M1極化。OPN與CD31共定位顯示其同步增強了成骨與血管生成過程。圖7與圖8通過轉(zhuǎn)錄組測序與驗證實驗深入闡明了其分子機制。在RAW 264.7細胞中，水凝膠通過抑制NF-κB p65磷酸化調(diào)控TLR/NF-κB等炎癥通路；在牙周膜干細胞中，則通過恢復(fù)氧化磷酸化通路功能、提升ATP合成與ATP5A蛋白表達，增強線粒體能量代謝，從而支持成骨分化。

圖6 動物實驗的免疫熒光染色結(jié)果 （A,B）CD206的免疫熒光圖像及定量分析；（C,D）iNOS的免疫熒光圖像及定量分析；（E–G）OPN與CD31的免疫熒光共染色圖像及其定量分析，用于評估成骨與血管生成。

圖7 RAW 264.7細胞的測序分析與驗證結(jié)果 （A）RAW 264.7細胞測序樣本的Pearson相關(guān)性熱圖；（B）RAW 264.7細胞中差異表達基因（DEGs）的火山圖；（C）RAW 264.7細胞中DEGs的層次聚類熱圖；（D）RAW 264.7細胞中DEGs的GO富集分析；（E）RAW 264.7細胞中DEGs的KEGG通路富集分析；（F）RAW 264.7細胞中NF-B信號通路示意圖；（G）磷酸化NF-B p65表達水平的Western blot結(jié)果。

圖8 PDLSCs的測序分析與驗證結(jié)果 （A）PDLSCs測序樣本的Pearson相關(guān)性熱圖；（B）PDLSCs中差異表達基因（DEGs）的火山圖；（C）PDLSCs中DEGs的層次聚類熱圖；（D）PDLSCs中DEGs的GO富集分析；（E）PDLSCs中DEGs的KEGG通路富集分析；（F）PDLSCs中氧化磷酸化通路示意圖；（G）PDLSCs中MitoTracker Deep Red FM染色結(jié)果（比例尺：20 μm）；（H）ATP活性測量結(jié)果比較；（I）ATP5A蛋白表達的Western blot（WB）結(jié)果。

綜上所述，HTF@HA水凝膠系統(tǒng)通過“順序釋放?多功能集成”策略，實現(xiàn)了在炎癥微環(huán)境中智能調(diào)控免疫反應(yīng)與持續(xù)促進組織再生的雙重目標。該研究不僅為炎癥相關(guān)牙周骨缺損的精準治療提供了新材料平臺，也為未來針對復(fù)雜疾病微環(huán)境的組織再生材料開發(fā)奠定了理論與技術(shù)基礎(chǔ)。

來源：高分子科學(xué)前沿

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