近年來,抗生素耐藥性已成為全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)。其中,多重耐藥金黃色葡萄球菌(MDR S. aureus)被世界衛(wèi)生組織列為重點防控的二級病原體,其對多種一線抗生素(如甲氧西林和萬古霉素)的耐藥性日益增強,使得傳統(tǒng)治療方法效果有限。細(xì)菌生物膜的形成進(jìn)一步增加了治療難度,亟需開發(fā)新型協(xié)同抗菌策略以應(yīng)對這一威脅。
為此,吉林大學(xué)孫靜教授、中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所陳學(xué)思院士合作成功開發(fā)出一種名為DACILy的pH響應(yīng)型抗菌納米囊泡,該體系通過整合靶向配體與多種抗菌劑,實現(xiàn)了對耐藥菌的高效精準(zhǔn)治療。DACILy由帶硫離子的抗菌聚肽類似物(PNSG-O-Cl)和經(jīng)2,3-二甲基馬來酸酐修飾的含氨基聚肽類似物(PNAG-DA)復(fù)合而成,并封裝了溶葡萄球菌酶(Ly)。在感染部位的酸性微環(huán)境中,納米囊泡解離并釋放抗菌成分,通過酶解細(xì)胞壁和破壞細(xì)胞膜的雙重機制,顯著增強了對MDR S. aureus及其生物膜的殺菌效果。相關(guān)論文以“Targeted Cascade Therapy with Multifunctional Nanovesicles Engineered from Synergistic Antibacterial Agents for Precision Treatment of Multidrug-Resistant Infections and Biofilms”為題,發(fā)表在
Advanced Materials上,論文第一作者為Gong Yiyu。
示意圖1. A) 靶向微環(huán)境響應(yīng)型抗菌聚肽類似物納米囊泡(DACILy)的構(gòu)建示意圖; B) 其抗菌作用模式示意圖。
研究中,團(tuán)隊首先篩選出具有協(xié)同抗菌效應(yīng)的聚合物與Ly(圖1)。棋盤法實驗顯示,PNSG-O-Cl與PNAG-NH?聯(lián)合Ly對多種S. aureus菌株表現(xiàn)出強烈協(xié)同作用,最低FIC指數(shù)低至0.188。進(jìn)一步通過TEM觀察證實,聯(lián)合處理可引起細(xì)菌細(xì)胞壁破損和膜結(jié)構(gòu)嚴(yán)重變形,表明Ly酶解作用增強了聚合物對細(xì)胞膜的攻擊。
圖1. 聚合物與Ly的協(xié)同抗菌效應(yīng)。A) Ly與多種聚肽類似物對不同S. aureus和MDR S. aureus菌株的FIC指數(shù);B–E) 對不同S. aureus菌株進(jìn)行的棋盤稀釋試驗,評估Ly與聚合物之間的協(xié)同作用。
隨后,研究人員構(gòu)建了靶向微環(huán)境響應(yīng)型納米囊泡DACI(圖2)。該囊泡在生理pH下保持穩(wěn)定,在pH 5.5時發(fā)生解離并釋放Ly,其zeta電位由負(fù)轉(zhuǎn)正,顯著增強與細(xì)菌的結(jié)合能力。共聚焦顯微鏡圖像顯示,F(xiàn)ITC標(biāo)記的DACI能特異性富集于細(xì)菌表面,而非哺乳細(xì)胞,證明其良好的靶向性。
圖2. 靶向微環(huán)境響應(yīng)型抗菌聚肽類似物納米囊泡的表征。A) DACI的負(fù)染色TEM圖像;B) DACI的AFM圖像;C) DACILy的負(fù)染色TEM圖像;D) DACILy的AFM圖像;E) FITC標(biāo)記的DACI與NR共染S. aureus USA300-R的CLSM圖像;F) FITC標(biāo)記的DACI與HUVEC和S. aureus共培養(yǎng)的CLSM圖像;G) DACI在不同pH下的zeta電位;H) SACI在不同pH下的zeta電位;I) DACILy在不同pH下Ly的累積釋放率;J) SACILy在不同pH下Ly的累積釋放率;K–N) DACI和SACI在pH 7.4和5.5下的負(fù)染色TEM圖像。
在體外抗菌實驗中(圖3),DACILy在pH 5.5條件下對多種S. aureus菌株表現(xiàn)出極強的殺菌能力,細(xì)菌存活率降至0.3%,遠(yuǎn)優(yōu)于單一組分或其他對照組。活死細(xì)胞染色進(jìn)一步顯示,DACILy處理組中紅色熒光(死菌)顯著增強,表明其能有效破壞細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)。
圖3. 體外抗菌活性。A) 囊泡在不同pH下對S. aureus和耐藥菌的殺菌 assay;B) 在pH 5.5下經(jīng)不同處理后的S. aureus USA300-R的Live/Dead染色CLSM圖像。
針對生物膜的研究表明(圖4),DACILy在預(yù)防和清除成熟生物膜方面均表現(xiàn)卓越,殺菌率高達(dá)99.9%。CLSM圖像顯示,經(jīng)DACILy處理的生物膜中幾乎無活菌存在,顯著優(yōu)于其他處理組。
圖4. 對MDR S. aureus生物膜的活性。A) 預(yù)防生物膜形成的能力;B) 清除成熟生物膜的能力;C) 抑制生物膜形成的CLSM圖像;D) 破壞成熟生物膜的CLSM圖像。
抗菌機制深入研究(圖5)通過膜電位去極化、膜通透性試驗和細(xì)胞內(nèi)容物泄漏檢測,證實DACILy能顯著增強膜破壞作用。SEM和TEM圖像進(jìn)一步顯示,經(jīng)DACILy處理的細(xì)菌出現(xiàn)膜結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破損和胞質(zhì)空洞化,說明其通過協(xié)同作用實現(xiàn)了高效殺菌。
圖5. 抗菌機制研究。A) 膜 depolarization 檢測;B) 膜通透性檢測;C) 260 nm處吸光度檢測胞內(nèi)容物泄漏;D) SEM圖像顯示細(xì)菌形態(tài)變化;E) TEM圖像顯示超微結(jié)構(gòu)變化。
在生物安全性方面,DACILy表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性和溶血性,HUVEC細(xì)胞存活率達(dá)76.3%,且在高濃度下仍無明顯溶血現(xiàn)象,顯示出良好的生物相容性。在小鼠皮膚傷口感染模型中(圖6),DACILy治療組細(xì)菌載量下降98.6%,傷口愈合速率達(dá)89.8%,組織切片顯示炎癥細(xì)胞浸潤減少,膠原和新生血管增多,病理評分最低。
圖6. 小鼠皮膚傷口感染模型中的抗菌效果。A) 實驗流程示意圖;B) 治療后細(xì)菌抑制率;C) 傷口愈合過程照片;D) 傷口大小變化統(tǒng)計;E) 治療后第7天組織H&E染色切片。
在肺部感染治療中(圖7–8),DACILy通過霧化給藥有效穿透黏液層,并在肺部滯留長達(dá)三天。治療組肺部細(xì)菌載量下降99.1%,炎癥因子(IFN-β、IL-6、IL-17A)水平顯著降低,同時肺組織修復(fù)蛋白(SP-C、VEGF-A、α-SMA)表達(dá)上升,表明其不僅能高效殺菌,還能促進(jìn)組織修復(fù)與抗炎反應(yīng)。
圖7. 肺部感染治療效果。A) 治療時間表示意圖;B) 肺部細(xì)菌培養(yǎng)圖像;C) 細(xì)菌抑制率統(tǒng)計;D) 肺組織H&E染色切片。
圖8. 感染小鼠治療后炎癥因子與修復(fù)蛋白的動態(tài)變化。A–C) BALF中IFN-β、IL-6、IL-17A的濃度;D–G) 肺組織中上述因子的免疫熒光染色與統(tǒng)計;H–K) 肺組織中SP-C、VEGF-A、α-SMA的免疫熒光染色與統(tǒng)計。
綜上所述,DACILy通過智能響應(yīng)細(xì)菌微環(huán)境、協(xié)同多種抗菌機制及精準(zhǔn)靶向遞送,為治療MDR細(xì)菌感染提供了創(chuàng)新性解決方案。其在皮膚和肺部感染模型中的出色表現(xiàn),展現(xiàn)出廣泛的臨床應(yīng)用潛力,為未來抗感染納米藥物開發(fā)指明了新方向。
來源:高分子科學(xué)前沿
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